ICS 11.220 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3208—2018 羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程 Technical Regulation for Isolation and Identification of Goat Contagious Ecthyma Virus 文稿版次选择 2018 - 10 - 20 发布 安徽省质量技术监督局 2018 - 11 - 20 实施 发 布 DB34/T 3208—2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽农业大学提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽东方帝维生物制品股份有 限公司、安徽省动物卫生监督所、阜阳市动物卫生监督所、亳州市谯城区畜牧兽医局、旌德县畜牧兽医 局、阜南县动物疫病预防与控制中心、肥东县动物疫病预防与控制中心、宿州市动物疫病预防与控制中 心 本标准主要起草人：王桂军、占松鹤、李雪松、祁克宗、朱良强、张星、张利亚、涂健、徐前明、 方保根、冯育宁、陈静、郑举、方定平、兰梦蝶、刘雪梅、周迎春、王军、王楠楠、杨德康、车跃光。 I DB34/T 3208—2018 羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了羊传染性脓疮病毒病料采集与处理、病毒分离及病毒鉴定技术要点。 本标准适用于羊传染性脓疮病毒的分离与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 3.1 试验材料、试剂和仪器 材料 增殖表皮癌细胞（HeLa）、羊睾丸原代细胞（Lamb testis cells，LT）、DMEM 培养基、M199 液 体培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、0.01 mol/L pH 7.0～7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）、青霉素、链霉素。 3.2 试剂 DNA 提取试剂盒、50 × TAE 缓冲液、琼脂糖。 3.3 仪器 细胞培养箱、生物安全柜、高速冷冻离心机、PCR 仪、电泳仪、紫外凝胶成像系统。 4 4.1 样品采集与处理 样品的采集 按照 NY/T 541 的规定执行，无菌采集疑似羊传染性脓疮病毒感染的病羊口唇、蹄部痂皮。 4.2 样品的保存 样品应置于 -80℃冷冻保存。 4.3 样品的处理 先将病料组织剪碎、研磨，用灭菌 PBS 与样品按体积质量比 5﹕1 匀浆，将样品匀浆冻存后再室 温融解，反复三次。经 5000 r/min 离心 10 min，取上清，并加入青霉素和链霉素，终浓度为 2000 IU/mL，0.22 μm 过滤除菌，置于 -80℃待用。 1 DB34/T 3208—2018 5 病毒分离 5.1 传代细胞培养 使用 DMEM 培养液复苏 HeLa 细胞，取 T25 细胞培养瓶密度达到 80％的单层 HeLa 细胞，弃去培 养液，用灭菌 PBS 清洗三次，接种 1 mL 处理好的样品，于 5％CO2 培养箱，37℃下吸附 2 h，期间每 隔 30 min 轻轻摇晃一次。弃去样品液，用灭菌 PBS 清洗三次，加入 5 mL 细胞维持液（血清含量为 2％），培养箱内继续培养 5 d。在培养过程中每日观察细胞病变（CPE）产生情况，如出现 CPE（特征 病变为：细胞间隙增大、细胞核固缩、细胞圆化脱落），收集细胞培养上清及细胞裂解液。 同时设立空白对照（见图1）。 A：病变的HeLa细胞； 图1 5.2 5.2.1 B：对照细胞 接种后第 72 小时病变的 HeLa 细胞和对照细胞 10× 原代细胞培养 原代细胞制作 选择 2～3 月龄健康雄性绵羊，无菌摘取睾丸，并浸泡于含双抗的 M199 培养基中保存，将睾丸组 织放入平皿中，剥弃髓鞘及白膜，除去脂肪层，用含双抗的灭菌 PBS 清洗 2～3 次，放入烧杯中将睾 丸组织剪碎，用含双抗的灭菌 PBS 清洗直至液体清亮，弃去液体，将组织倒入装有玻璃珠的三角瓶中， 按组织量的 4 倍加入胰酶消化液，37℃消化 30 min，至睾丸组织呈蓬松状，加入 M199 培养液清洗， 将胰酶消化液彻底冲洗干净，加入适量生长液（含 10％血清的 M199 培养基），用玻璃珠振荡法分散 细胞，6 层纱布进行过滤，取滤液进行细胞计数，用生长液将细胞密度调整为 100～150 万个/mL的细 胞悬液，7 mL/瓶（T25 细胞培养瓶），置 37℃、5％ CO2 培养箱中进行培养。 5.2.2 病毒分离 使用 M199 培养液培养 LT 细胞，取 T25 细胞培养瓶密度达到 80％的单层 LT 细胞，弃去培养液， 用灭菌 PBS 清洗三次，接种 1 mL 处理好的样品，于 5％CO2 培养箱，37℃下吸附 1 h，期间每隔 15 min 轻轻摇晃一次。吸附完成后，弃去样品液，用灭菌 PBS 清洗三次，加入 5 mL 细胞维持液（血清含量 为 2％），培养箱内继续培养 4 d。在培养过程中每日观察 CPE 产生情况，如出现 CPE，收集细胞培 养上清及细胞裂解液。 同时设立空白对照（见图2）。 2 DB34/T 3208—2018 A：病变的羊睾丸原代细胞； 图2 6 6.1 B：对照细胞 接种后第 72 小时病变的羊睾丸原代细胞和对照细胞 100× 病毒 PCR 检测 引物 B2L gene 上游引物：5’-CGGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTCCAT-3’ B2L gene 下游引物：5’-CGGAATTCTTAATTTATTGGTTTGCAGAACTCC-3’ 6.2 病毒 DNA 提取与 PCR 检测 利用 DNA 提取试剂盒提取待测样品以及羊痘阳性病料 DNA，以此作为 PCR 扩增模板。 PCR 扩增反应条件：94℃预变性 3 min；94℃45s，58℃45s，72℃70s，30 个循环；最后 72℃延 伸 10 min。取 PCR 产物用 10 g/L 琼脂糖凝胶进行电泳检测，阳性结果为在 1137 bp 处扩增出特异 性条带（见图3）。 图中： M —— DL 2000Marker；1 —— 待检样品；2 —— 羊痘阳性病料；3 —— 阴性对照。 图3 7 B2L 基因的 PCR 扩增 结果判定 3 DB34/T 3208—2018 7.1 HeLa 细胞接种病料 72 h 后，开始出现细胞核固缩、细胞圆化脱落。 7.2 羊睾丸原代细胞接种病料 72 h 后，开始出现细胞核固缩、细胞圆化脱落。 7.3 PCR 检测结果得到与理论上 B2L 基因片段大小（1137 bp）相符的目的条带大小目的片段时，且 羊痘阳性病料未出现条带，初步判定为羊传染性脓疮病毒阳性，结果具有特异性。 7.4 符合结果判定 7.3，且符合 7.1 或 7.2 时，可确诊被检羊感染羊传染性脓疮病毒。 _________________________________ 4