ICS 11.220 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2850—2017 番鸭细小病毒 PCR 检测方法 Detection Method of Muscovy Duck Parvovirus by PCR 文稿版次选择 2017 - 03 - 30 发布 安徽省质量技术监督局 2017 - 04 - 30 实施 发 布 DB34/T 2850—2017 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、安庆永强农业科技股份有限公司。 本标准起草人：戴银、潘孝成、胡晓苗、张丹俊、黄永强、赵瑞宏、周学利、侯宏艳、沈学怀、胡 业和、夏生林、吴娟、王骏俊、朱传民。 I DB34/T 2850—2017 番鸭细小病毒 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了番鸭细小病毒的PCR检测方法。 本标准适用于番鸭肝脏、脾脏、胰腺病变组织、番鸭胚尿囊液中番鸭细小病毒核酸的检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 番鸭细小病毒 Muscovy Duck Parvovirus，MDPV 属于细小病毒科、细小病毒亚科、依赖病毒属，基因组为线性、单链 DNA。 3 检测方法 3.1 仪器 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.1.8 PCR 仪扩增仪。 台式低温高速离心机，温控范围：-4℃～25℃。 电泳仪，电压范围：60-120V。 凝胶成像系统。 冰箱。 微波炉。 水浴锅，温控范围：37℃～100℃。 微量移液器，可调量程：0.5～10 ul，10～100 ul，100～1000 ul。 3.2 试剂和材料 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6 3.2.7 3.2.8 3.2.9 3.2.10 细胞裂解液，见附录 A 中的 A.1。 酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇。 蛋白酶 K。 灭菌双蒸水。 Taq DNA 聚合酶。 dNTP。 DNA 分子量标准：DL 2000 DNA Marker。 溴化乙锭（EB，10 µg/µL）或核酸染料。 磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.2），见附录 A 中的 A.2。 50×TAE 电泳缓冲液，见附录 A 中的 A.3。 1 DB34/T 2850—2017 3.2.11 1％琼脂糖凝胶，见附录 A 中的 A.4。 3.2.12 1×TE 缓冲溶液，见附录 A 中的 A.5。 3.2.13 根据番鸭细小病毒的基因组序列保守区，设计 1 对特异性引物：上游引物 5’GCTCTTTGCTTCAGTTGCTC -3’，下游引物 5’- ACTTGCTTCTCCTCCACTAT -3’ 。扩增基因片段长度为 861 bp。 3.2.14 阳性对照样品：MDPV 接种的番鸭胚尿囊液；阴性对照样品：未接种的正常番鸭胚尿囊液。 3.3 操作步骤 3.3.1 样品的采集及处理 采样工具 ——15 mL 离心管、1.5 mL 离心管、剪刀、镊子和研钵，经 121（±2）℃， 15 min 高压灭菌并 烘干。 b) 病料的采集与处理 ——无菌采集病死或剖杀的番鸭肝脏、脾脏、胰腺病变组织剪碎，按 1:5 倍体积加入 PBS，研磨， 装入 15 mL 灭菌离心管中，5000 rpm 离心 10 min，取上清液转入 1.5 mL 离心管中，-20℃ 保存备用。 c) MDPV 接种的番鸭胚尿囊液 ——将尿囊液经 5000 rpm/min 离心 10 min，取上清转入 1.5 mL 离心管中，-20℃保存备用。 a) 3.3.2 DNA 的提取 a) b) c) d) e) 阳性对照、阴性对照和待检样品同时提取 DNA。取 200 μL 样品和 800 μL 细胞裂解液置于一个 1.5 mL 离心管中，加蛋白酶 K 10 μL（2 mg/ml），颠倒混匀。 在 65℃恒温水浴锅中水浴 30 min，或在 37℃恒温箱中 1 h，间歇振荡数次。12000 rpm 离心 5 min，取上清入另一 EP 管中。 加入等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），室温振荡 5 min，12000 rpm 离心 5 min，取上清 入另一 EP 管中。可以抽提两次。 加等体积的异丙醇，轻摇 5 min，室温放置 5 min，12000 rpm 离心 5 min，弃上清。 加入 800 μL 70％乙醇，12000 rpm 离心 5 min，弃上清，干燥 15～20 分钟，加入 20～30 μL TE，-20℃保存或直接 PCR。 3.3.3 PCR PCR 反应体系 ——10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，上游引物和下游引物（20 pmol/µL） 各 1.0 μL，DNA 1μL，Taq DNA 聚合酶 0.25 μL，加双蒸水补足 25 μL。 b) PCR 反应条件 ——94℃预变性 5 min 后；94℃ 1 min，47℃ 1.5 min，72℃ 2 min，33 个循环；最后 72℃延 伸 10 min。 a) 3.4 电泳 将 PCR 扩增产物 5 μL 与 2 μL 上样缓冲液混合，点样于 1％琼脂糖凝胶板加样孔中，琼脂糖凝 胶板一侧点样孔加入 DL2000 DNA Marker，缓冲液为 1×TAE，以 5 V/cm 电压电泳 30 min 左右。 3.5 结果判定 2 DB34/T 2850—2017 当阳性对照出现 861 bp 扩增条带，阴性对照未出现目的条带时，实验结果成立。 被检样品出现 861 bp 扩增条带为 MDPV 核酸阳性，未出现 861 bp 扩增条带的样品判为 MDPV 核 酸阴性。 图1 为检测结果图示。 图中： M， DL2000 Marker； 1、2，阳性样品； 3，阳性对照样品； 4，阴性对照样品。 图1 PCR 产物电泳图 3 DB34/T 2850—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂配制 A.1 细胞裂解液的配制 A.1.1 1 mol/L Tris 溶液：称取 Tris 242.2 g，加双蒸水至 1600 mL，加热溶解，定容至 2000 mL。 A.1.2 1 mol/L Tris-HCL pH 8.0 溶液：称取 1M Tris 溶液 160 mL 用分析纯盐酸调至 pH 8.0（需 浓盐酸约 8.5 mL） ，加双蒸水定容至 200 mL，高压灭菌备用。 A.1.3 10 mol/L NaCL 溶液：称取 292.2 g NaCL，加入 500 mL 蒸馏水中，搅匀备用。 A.1.4 0.5 mol/L EDTA 溶液：称取 EDTA-Na2 37.2 g 先用 140 ml 双蒸水溶解，加入 14 ml NaOH（1 0 mol/L）使 EDTA-Na2 溶解，再用 NaOH（10 mol/L）溶液调至 pH 8.0，加双蒸水定容至 200 mL，高 压灭菌备用。 A.1.5 10％SDS 溶液：在 900 mL 蒸馏水中溶解 100 g SDS，加热至 68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节 溶液的 pH 值至 7.2，加水定容至 1 L，无须灭菌，分装备用。 A.1.6 量取 1 mol/L Tris-HCL 溶液 3 mL、 10％SDS 溶液 1 mL、 0.5 M EDTA 溶液 0.5 mL、10 M NaCL 溶液 4 mL 加入灭菌双蒸水，定容至 50 mL。 A.2 0.01 mol/L pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 A.2.1 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）71.6 g，先加适量灭菌双蒸水 溶解，最后定容至 1000 mL，混匀。 A.2.2 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2 PO4•H2O）27.6 g，先加适量灭菌双蒸水溶 解，最后定容至 1000 mL，混匀。 A.2.3 量取 0.2 moL/L 磷酸氢二钠溶液 36 mL，0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液 14 mL，称取 NaCL 8.5 g，用灭菌双蒸水溶解稀释至 1000 mL，4℃保存。 A.3 50×TAE 缓冲液（贮存液）配制 Tris 碱 242 g，冰醋酸 57.0 mL，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）100 mL 搅拌溶解后，用 NaOH 调 pH 至 8.3，加灭菌双蒸水定容至 1000 mL，常温保持备用。 贮存液按 1：50 稀释后即为工作液。 A.4 1％琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖（电泳级） 1 g 1×TAE 电泳缓冲液 100 mL 微波炉中完全融化，降温至 60℃左右，加核酸染料 5 μL，均匀铺板。 A.5 1×TE 缓冲溶液的配制 4 DB34/T 2850—2017 量取 1 moL/L Tris-HCl（pH 8.0）5 mL，0.5 moL/L EDTA （pH 8.0）1 mL 于 500 mL 烧杯中， 向烧杯中加入约 400 mL 双蒸水均匀混合，定容到 500 mL 后，高温高压灭菌,室温保存。 _________________________________ 5