ICS 11.220 B 41 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1760—2018 H7 亚型禽流感抗原胶体金免疫层析检测试 纸条的制备和在活禽中快速检测技术规程 Preparation of Avian Influenza H7 antigen golden immuno-chromotography detection test strip and technical specification for rapid detection in live poultry 2018 - 04 - 03 发布 福建省质量技术监督局 2018 - 07 - 03 实施 发 布 DB35/T 1760—2018 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 疫病概述 .......................................................................... 1 4 原理 .............................................................................. 2 5 仪器设备和主要试剂 ................................................................ 2 6 H7 亚型禽流感抗原胶体金免疫层析快检测试纸条的制备 .................................. 3 7 活禽中 H7 亚型禽流感病毒快速检测 ................................................... 4 附录 A（规范性附录） 溶液的配制 ...................................................... 5 附录 B（资料性附录） 胶体金免疫层析快速检测试纸条的装配示意图 ........................ 7 I DB35/T 1760—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由福建出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心、深圳市易瑞生物技术有限公司、厦门 瑞德利校准检测技术有限公司、福州市疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：郑腾、张体银、唐寰宇、付辉、金虹、林杰、张险朋、李文最、杨年松、朱海、 张永东、王武军、张志灯、白泉阳、李宋钰。 II DB35/T 1760—2018 H7 亚型禽流感抗原胶体金免疫层析检测试纸条的制备 和在活禽中快速检测技术规程 1 范围 本标准规定了H7亚型禽流感抗原胶体金免疫层析检测试纸条的制备要求和快速检测的原理及操作 步骤。 本标准适用于H7亚型禽流感抗原胶体金免疫层析快速检测纸条的制备，并适用于活禽中H7亚型禽流 感病毒的快速诊断和初筛。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 疫病概述 3.1 H7 亚型禽流感病毒是 A 型流感病毒的一种亚型，属于正粘病毒科的 A 型流感病毒属。禽流感病毒 颗粒外膜由两型表面糖蛋白组成，呈短杆状或球状，具有多形性，其中球形直径 80 nm～120 nm，有囊 膜，核衣壳为螺旋对称，基因组为分节段单股负链 RNA，大小约 14 000 个核苷酸，由 8 个片段组成， 共编码 10 种蛋白，包括血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）、基质蛋白 （matrix protein，M1、M2）、依赖 RAN 的 RNA 聚合酶（PA、PBl、PB2）、核蛋白（nucleoprotein， NP）和非结构蛋白（nonstmctural protein，NSl、NS2）。依据其 HA 和 NA 蛋白抗原性不同，目前可分 为 16 个 H 亚型（H1～H16）和 9 个 N 亚型（N1～N9）。理论上 HA 与 NA 的不同组合可形成多达 144 种不 同的禽流感病毒，许多高致病性禽流感病毒常常为 H7 亚型，如可以引起人死亡的 H7N9 禽流感病毒就属 于该亚型。 3.2 高致病性禽流感在禽群之间的传播主要依靠水平传播（如空气、粪便、饲料和饮水等），垂直传 播则可以通过鸡蛋传播。病毒可以随病禽的呼吸道、眼鼻分泌物、粪便排出，禽类通过消化道和呼吸道 途径感染发病。被病禽粪便、分泌物污染的任何物体，如饲料、禽舍、笼具、饲养管理用具、饮水、空 气、运输车辆、人、昆虫等都可能传播病毒。许多家禽都可感染病毒发病：火鸡、鸡、鸽子、珍珠鸡、 鹌鹑、鹦鹉等陆禽都可感染发病，但以火鸡和鸡最为易感，发病率和死亡率都很高；鸭和鹅等水禽也易 感染，并可带毒或隐性感染，有时也会大量死亡。各种日龄的鸡和火鸡都可感染发病死亡，而水禽（如 雏鸭、雏鹅）的死亡率较高。除野禽，如天鹅、燕鸥、野鸭、海岸鸟和海鸟等外，还从以下多种鸟中分 离到流感病毒；燕八哥、石鸡、麻雀、乌鸦、寒鸦、鸽、岩鹧鸪、燕子、苍鹭、加拿大鹅及番鸭等。据 国外报道，已发现带禽流感病毒的鸟类达 88 种，而鼠类不能自然感染流感病毒。不同品种的家禽感染 禽流感的几率不同，但目前尚未发现高致病性禽流感的发生与禽的性别有关。人类会通过与感染的物品、 排泄物和感染禽类的分泌物接触发生感染。高致病性禽流感感染人后会使人产生严重的呼吸道症状，严 重时可令人致死。 1 DB35/T 1760—2018 4 原理 本标准是利用双抗体夹心法胶体金免疫层析技术检测样品中H7亚型禽流感病毒。如果样品中含有H7 亚型禽流感病毒，在层析过程中样品中的H7亚型禽流感病毒HA蛋白会先与胶体金标记的特异性H7亚型禽 流感抗原单克隆抗体A结合形成抗原抗体复合物，并层析至硝酸纤维素膜上检测区时，该复合物被检测 区固定的特异性H7亚型禽流感抗原单克隆抗体B捕获，并逐渐凝集成形成一条可见的检测线。而未被检 测区捕获的复合物层析至质控区时，被质控区的二抗捕获，也逐渐凝集成形成一条可见的质控线。因此 样品中含有H7亚型禽流感病毒时，检测线和质控线同时有可见条带；如果样品中不含有H7亚型禽流感病 毒时，检测线则无可见条带，质控线有可见条带。如果质控线未出现条带，则表明试纸无效。 5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 仪器设备主要包括以下几项： a) 微量可调移液器（10 μL、200 μL、1 000 μL）； b) 恒温培养箱（25 ℃±5 ℃）； c) 磁力搅拌器； d) 高速冷冻离心机（10 000 r/min～12 000 r/min）； e) 除湿机； f) 切条机； g) 划膜喷金机； h) 冰箱（2 ℃～8 ℃）； i) 计时器。 5.2 主要试剂 主要试剂包括： a) 氯金酸； b) 叠氮钠（NaN3）； c) 柠檬酸三钠； d) 碳酸钾； e) H7 亚型禽流感抗原单克隆抗体 A； f) H7 亚型禽流感抗原单克隆抗体 B； g) 甘氨酸； h) 磷酸盐缓冲溶液（PBS）； i) 牛血清白蛋白（BSA）； j) 吐温 20（Tween-20）； k) 蔗糖； l) 聚乙烯吡咯烷酮 （PVP）； m) 三羟甲基氨基甲烷（Tris）； n) 抗鼠 IgG 多克隆抗体； o) 硝酸纤维素膜； p) 玻璃纤维结合垫； 2 DB35/T 1760—2018 q) 聚氯乙烯底板（PVC 底板）； r) 吸水滤纸； s) 样品垫； t) H7 亚型禽流感抗原阳性对照和阴性对照，由指定单位提供。 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682-2008中一级水的 要求。 6 6.1 H7 亚型禽流感抗原胶体金免疫层析快检测试纸条的制备 胶体金颗粒的制备 6.1.1 取 1%的氯金酸(配制方法见附录 A 中的 A.1)1 mL，加入 99 mL 的水，制备稀释成 0.01%的氯金 酸溶液。 6.1.2 取 0.01%的氯金酸溶液 100 mL 置于干净的烧杯或锥形瓶中，在磁力搅拌器上加热并快速搅拌， 待初沸，一次性快速加入 1%的柠檬酸三钠溶液(配制方法见附录 A 中 A.2)1 mL，其后持续搅拌。应注意 加液用的工具（如枪头或注射器等）和所有容器必须洁净，如果要重复使用必须经酸洗并用水冲净。 6.1.3 虽然金的还原以及成核反应很迅速，但整个过程相对比较漫长，可以观察到明显的颜色变化。 首先是氯金酸溶液的黄色，随后出现浑浊而呈现灰黑色，最后出现透亮的红色。此时可以停止加热，继 续低速搅拌约 5 min 后，静置冷却至室温。 6.1.4 待冷却后定容至 100 mL，避光待用。无需过滤，2 ℃～8 ℃下冷藏存放，可保存半年，不可冷 冻。 6.1.5 胶体金应保存在洁净的玻璃器皿中，可以加入 0.02%的 NaN3 作为防腐剂。保存不当时，会有细 菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速 离心去除凝集颗粒。 6.2 H7 亚型禽流感抗原单克隆抗体 A 的标记 6.2.1 取 1 mL 胶体金置于 1.5 mL 离心管内，加入 0.2 mol/L 碳酸钾(配制方法见附录 A 中 A.3)10 μL，并混匀。 6.2.2 加入 4 μg 的 H7 亚型禽流感抗原单克隆抗体 A 进行标记，混匀并静置 30 min。 6.2.3 加入 0.2 mol/L 的甘氨酸(配制方法见附录 A 中 A.4)100 μL 进行封闭，混匀并静置 30 min。 6.2.4 在 4 ℃下 10 000 r/min 冷冻离心 30 min，弃去上清液。 6.2.5 加入 100 μL 重悬液（配制方法见附录 A 中的 A.5），搅匀