ICS 11.220 B41 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1593—2016 禽坦布苏病毒病诊断技术 Diagnostic techniques for avian Tembusu virus infection 2016 - 08 - 22 发布 福建省质量技术监督局 2016 - 11 - 22 实施 发 布 1 DB35/T 1593-2016 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：万春和、黄瑜、傅光华、傅秋玲、白泉阳、施少华、程龙飞、陈珍、陈翠腾、 陈红梅、朱春华、刘荣昌。 I DB35/T 1593-2016 禽坦布苏病毒病诊断技术 1 范围 本标准规定禽坦布苏病毒病的临床诊断要点和病毒核酸诊断的反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的 操作技术规程。 本标准适用于禽坦布苏病毒病的临床诊断和实验室诊断。 2 疫病概述 禽坦布苏病毒病在我国家禽业中，尤其是蛋鸭、种鸭中广泛流行，临床表现以高热、采食量骤降、 产蛋率骤降和种（蛋）禽卵巢（卵泡）严重出血或（和）卵黄液化为特征。该病在我国不同地区、不同 品种鸭群发病率高低不一，群内发病率几乎为100%，病死率为0～12%。禽坦布苏病毒除主要侵害不同品 种的种（蛋）鸭外，还危害肉鸭（如樱桃谷肉鸭、半番肉鸭等），临床上以共济失调、软脚、脑炎和肝 脏局灶性出血为特征。 禽坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属成员，为有囊膜病毒，其基因组为单股正链RNA，长度约为11 kb，含有一个长度为10 278 bp开放阅读框，编码含3 425个氨基酸的多聚蛋白，其各组成蛋白依 次为5’-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’。禽坦布苏病毒在遗传进化上与黄病毒科 黄病毒属可经蚊虫传播的病毒遗传进化关系较近，但禽坦布苏病毒病在冬春寒冷季节蚊虫较少时仍有发 生，可通过直接接触和气溶胶传播，也有禽坦布苏病毒垂直传播的报道。 3 3.1 临床诊断 临床症状 当禽（尤其是种禽、蛋禽）出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据之一： a) 体温急剧升高，采食量骤降； b) 产蛋率骤降； c) 开产种（蛋）禽产蛋率上升慢、持续低产蛋率、无产蛋高峰或（和）产蛋率时高时低（适于种 禽、蛋禽）； d) 后备种（蛋）禽开产推迟或（和）产蛋不整齐； e) 双脚无力、共济失调或（和）双翅下垂。 3.2 剖检病变 当禽（尤其是蛋禽）出现以下肉眼可见病变时，可作为初步诊断的依据之一： a) 种（蛋）禽卵巢（卵泡）出血； b) 种（蛋）禽卵泡内卵黄液化，卵泡变形； c) 种（蛋）禽腹腔内积有淡红色血水或淡黄色浑浊液体； d) 种（蛋）禽卵巢（卵泡）萎缩，卵泡数量减少； 1 DB35/T 1593-2016 e) 肉禽肝脏局灶性出血或（和）脑组织轻度出血。 3.3 初步诊断 当禽（包括后备种蛋禽）出现3.1的临床症状之一或3.2中剖检病变之一时，可作出初步诊断；需确 诊，应进行实验室进一步诊断。 4 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）诊断 4.1 样品采集与处理 采集发病禽、濒死禽或死亡禽（尤其是种禽、蛋禽）的卵巢、肝脏、脑组织样品。将采集的组织经 剪碎处理后，与磷酸盐缓冲液（PBS，见附录A.1）按照体积比1：4的比例制成组织匀浆液，反复冻融3 次，8 000 rpm离心30 min，取上清冻存分装备用。 4.2 主要仪器设备 主要仪器设备有： a) PCR 仪； b) 高速台式冷冻离心机； c) 微量移液器； d) 组织匀浆器； e) 电泳仪； f) 电泳槽； g) 紫外凝胶成像系统。 4.3 试剂 采用的试剂有： a) RNA 提取试剂 Trizol； b) 三氯甲烷； c) 异丙醇； d) 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水：配制方法见附录 A.2； e) 75%乙醇：配制方法见附录 A.3； f) 溴化乙锭溶液：配制方法见附录 A.4； g) 1×TAE 缓冲液：配制方法见附录 A.5； h) 1.0% 琼脂糖凝胶：配制方法见附录 A.6； i) DNA 相对分子质量标准物：DL2 000； j) 10×加样缓冲液：配制方法见附录 A.7。 4.4 引物 根据禽坦布苏病毒的非结构蛋白NS5基因保守区特征设计特异性引物，引物序列为，上游引物 F：5’- CTAYCAYGGAAGYTACGAAGT -3′和下游引物R：5′- CTTTTCTCGCTTYCCCATCAT -3′，用于扩增目的条带 约469 bp大小的NS5基因片段。序列中含有的简并碱基Y =C/T。 4.5 2 核酸 RNA 提取 DB35/T 1593-2016 核酸RNA提取方法如下： a) 取 250 μL 组织匀浆液加入 1.5 mL 灭菌离心管后，加入 750 μL RNA 提取试剂 Trizol，充分 混匀 15 s，再加入 200 μL 预冷的三氯甲烷，充分倒置混匀，室温静置 10 min； b) 4 ℃条件下，12 000 rpm 离心 15 min。取经焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水处理的 1.5 mL 灭菌 离心管，小心吸取离心上清液 600 μL，加入等体积－20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀。 c) 4 ℃条件下，12 000 rpm 离心 15 min。轻轻倾倒上清液，加入 800 μL 75%乙醇清洗 2 次， 倒置于吸水纸上 5 min，室温晾干。 d) 加入 20 μL 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水，轻轻混匀溶解离心管壁上核酸 RNA，2000 rpm 离 心 30 s，提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增或保存于－80℃冰箱备用。 e) 也可采用市售商品化的等效核酸 RNA 提取试剂盒，完成核酸 RNA 提取。 4.6 对照 以灭活的禽坦布苏病毒提取的核酸RNA为阳性对照；以其他禽源RNA病毒（如鸭Ⅰ型肝炎病毒）提取 的核酸RNA为阴性对照；以灭菌双蒸水为空白对照。 4.7 RT-PCR 扩增 RT-PCR反应体系为25 μL，每个反应管的反应液配置为：依次加入14 μL焦炭酸二乙酯（DEPC）处 理水，2.5 μL反转录酶缓冲液，2.5 μLTaq聚合酶缓冲液，0.5 μL dNTP，0.5 μL Taq聚合酶，0.5 μL 反 转录酶，0.5 μL RNA酶抑制剂，上下游引物（引物浓度均为20μM）各0.5 μL，提取的核酸RNA3 μL。2000 rpm离心15 s，使反应混合液都沉降到PCR管底。将上述反应混合液按照以下步骤进行一步法RT-PCR扩增， 第一步是反转录，42 ℃反转录30 min； 第二步PCR循环，94 ℃预变性5 min； 循环参数为94 ℃变性 50 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，循环30次；第三步72 ℃再延伸7 min结束。 也可采用市售商品化的等效RT-PCR检测试剂盒，并按照市售商品化的等效RT-PCR检测试剂盒推荐的 条件进行。 4.8 RT-PCR 产物电泳 反应结束后，分别取5 μL RT-PCR产物与0.5μL 10×加样缓冲液混合，然后加入到1.0%琼脂糖凝胶 板的加样孔中，加上DNA分子量标准5 μL，以5 V/cm的电压进行电泳，30 min后在紫外凝胶成像系统观 察结果。 4.9 结果判定 当阳性对照出现469 bp特异性条带（见附录B电泳图2号泳道）、阴性对照无扩增条带（见附录B电 泳图3号泳道），空白对照无扩增条带（见附录B电泳图4号泳道）本次实验结果有效；当待检样品出现 469 bp特异性条带（见附录B电泳图5号泳道）判为阳性，无特异性扩增条带（见附录B电泳图6号泳道） 判为阴性。 3 DB35/T 1593-2016 AA 附 录 A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 0.01M 磷酸盐缓冲液（PBS） NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4·12H2O 2.9 g KH2PO4 0.2 g 5 将上述试剂溶于800 mL灭菌双蒸水中，定容至1 000 mL，1.034×10 Pa高压灭菌30 min，4 ℃保存 备用。 A.2 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水 5 于三蒸水按0.1%加入DEPC，室温静置过夜，1.034×10 Pa高压灭菌20 min，冷却备用。 A.3 75%乙醇 取无水乙醇750 mL加入灭菌双蒸水250 mL，定容至1 000 mL，－20℃保存备用。 A.4 溴化乙锭（EB）溶液 溴化乙锭 20 mg 灭菌双蒸水 至20 mL 说明：也可采用市售商品化的更环保、更安全Goldviewer等荧光染料。 A.5 1×TAE电泳缓冲液 A.5.1 配制0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液 （pH8.0） 二水乙二铵四乙酸二钠 氢氧化钠 灭菌双蒸水 A.5.2 18.61 g 调pH至8.0 至100 mL 配制50×TAE电泳缓冲液 羟基甲基氨基甲烷（Tris） 冰乙酸 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0） 灭菌双蒸水 用时用灭菌双蒸水稀释50倍使用。 4 242 g 57.1 mL 100 mL 至1 000 mL DB35/T 1593-2016 A.5.3 配制1×TAE电泳缓冲液 50×TAE电泳缓冲液 灭菌双蒸水 A.6 20 mL 至1 000 mL 1.0%琼脂糖凝胶 琼脂糖 1.0 g 1×TAE电泳缓冲液 至100 mL 置微波炉中加热至完全融化，待冷至50℃~ 60℃时，加溴化乙锭（EB）溶液5µL，摇匀后倒入制胶 板中，待完全凝固后取下加样梳，备用。 A.7 10×加样缓冲液 聚蔗糖 溴酚蓝 二甲苯青 灭菌双蒸水 25 g 0.1 g 0.1 g 至100 mL 5 DB35/T 1593-2016 BB 附 录 B （资料性附录） RT-PCR 检测结果电泳图 图B.1 RT-PCR 检测结果电泳图 说明：1——DNA分子量标准； 2——阳性对照； 3——阴性对照； 4——空白对照； 5——待检样品（阳性）； 6——待检样品（阴性）。 _________________________________ 6 DB35/T 1593－2016 福 建 省 地 方 标 准 禽坦布苏病毒病诊断技术 DB35/T 1593—2016 * 2017 年 4 月