ICS 65.020.30 B 41 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 1843—2014 猪 A 群轮状病毒 RT-PCR 检测技术规范 2014 - 09 - 19 发布 四川省质量技术监督局 2014 - 10 - 01 实施 发 布 DB51/T 1843—2014 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 设备和试剂 ........................................................................ 1 5 RNA 提取........................................................................... 2 6 反转录 ............................................................................ 3 7 PCR 扩增........................................................................... 3 8 PCR 产物的电泳检测................................................................. 3 9 结果判定 .......................................................................... 3 10 废弃物无害化处理 ................................................................. 3 附录 A（规范性附录） 相关试剂的配制 .................................................. 5 I DB51/T 1843—2014 前 言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：西南民族大学。 本标准主要起草人：任玉鹏、岳华、汤承、张斌、张焕容、杨发龙、王远微。 II DB51/T 1843—2014 猪 A 群轮状病毒 RT-PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了猪 A 群轮状病毒 RT-PCR 检测方法。 本标准适用于猪只感染猪 A 群轮状病毒的检测、诊断和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 《兽医实验室生物安全技术管理规范》（2003农业部公告第302号） 3 术语和定义 本标准采用下列术语和定义。 3.1 猪 A 群轮状病毒 group A porcine rotavirus，GAR 猪轮状病毒（porcine rotavirus, PRV）是呼肠孤病毒科、轮状病毒属成员，基因组由11个节段的双 股正链 RNA 组成；PRV 主要包括 A、B、E、C 四个血清型，临床上猪只感染以猪A群轮状病毒（group A porcine rotavirus, GAR）为主； 3.2 猪 A 群轮状病毒病 以猪 A 群轮状病毒为主要病原，引起剧烈呕吐、腹泻和脱水等为特征的人畜共患胃肠道传染病。 4 设备和试剂 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.1.7 主要仪器和设备 PCR 扩增仪 电泳仪、水平电泳槽 凝胶成像系统 冷冻高速离心机 微量高速离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作） 高压蒸汽灭菌锅 涡旋仪 1 DB51/T 1843—2014 4.1.8 4.1.9 4.2 恒温水浴锅 移液器（0.1μL～2.5μL、0.1μL～10μL、20μL～200μL、200μL～1000μL） 主要试剂 4.2.1 引物（10μmol/L） P1：5’-TCAAGCACGATTTGGAAC- 3’ P2：5’ -GCCTGGTGGAAATACTGGTC- 3’ 扩增片段长度 274 bp。 4.2.2 变性液:见附录 A.1。 4.2.3 2 mol/L 醋酸钠溶液 (pH4.0)：见附录 A.2。 4.2.4 水饱和酚 (pH 4.0)。 4.2.5 氯仿/异戊醇 (49/1)混合溶液。 4.2.6 PrimescriptTM RT 试剂盒 4.2.7 Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL)。 4.2.8 1.0% 琼脂糖凝胶：见附录 A.3。 4.2.9 50×TAE 缓冲液：见附录 A.4。 4.2.10 核酸染料 (Goldview)。 4.2.11 DEPC 处理的灭菌双蒸水：见附录 A.5。 4.2.12 异丙醇。 4.2.13 DEPC 处理的灭菌双蒸水配置的 75%乙醇：见附录 A.6。 4.2.14 2.5 mmol dNTPs。 4.2.15 10×PCR 缓冲液。 4.2.16 6 ×上样缓冲液（6 × Loading Buffer）。 4.2.17 DNA 分子量标准 DL600。 4.2.18 水：所用水应符合 GB/T 6682 中三级水(三蒸水)规格。 4.2.19 阳性对照：猪 A 群轮状病毒 CVCC AV69 株购自国家兽医微生物菌种保存中心。 4.2.20 阴性对照：用符合 GB/T 6682 中的三级水代替 RT-PCR 扩增模板。 5 RNA 提取 5.1 样本处理 5.1.1 肠内容物：选择疑似病症的猪只，无菌采集小肠内容物 1g，用 10 mmol/L PBS 缓冲液稀释 10 倍；在涡旋仪上振荡混匀后反复冻融 2 次，10000 r/min 离心 10 min，取上清液备用。 5.1.2 肛门拭子：将肛门拭子等棉拭子浸入 1mL 的 10 mmol/L PBS 缓冲液中 30 min，充分混匀后反复 冻融 2 次，12000 r/min 离心 10 min，取上清液备用。 5.1.3 腹泻粪便：采集病猪新腹泻粪便 1g，用 10 mmol/L PBS 缓冲液将粪便稀释 10 倍，在涡旋仪上 振荡混匀后反复冻融 2 次，10000 r/min 离心 10 min，取上清液备用。 5.1.4 对照样本：阴阳性样本处理与检测样本处理方法相同。 5.2 5.2.1 2 异硫氰酸胍一步法抽提 RNA 每次试验前应设立阳性和阴性对照。 DB51/T 1843—2014 5.2.2 取处理后待检样品上清液 100 μL，加入变性液 300 μL 颠倒混匀，加入 30μL 2 mol/L 乙 酸钠（pH 值 4.0）。反复颠倒离心管 5 次，在 25 ℃ 的室温下放置 5 min。12000 r/min、4 ℃ 离心 并取上清。 5.2.3 依次加入 150 μL 饱和酚、150 μL 氯仿-异戊醇，反复颠倒混匀 5 次，冰浴 15 min。 5.2.4 12000 r/min、4℃ 离心 20 min，将上层含 RNA 的水相移入一新管中，不应吸取水相的最下层。 5.2.5 加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰浴静置 10 min 沉淀 RNA。 5.2.6 12000 r/min、 4℃离心 10 min，弃上清。 5.2.7 加入 1 mL 用 DEPC 水配制的 75%乙醇颠倒混匀洗涤沉淀，12000 r/min、4℃ 离心 10 min，弃 上清。 5.2.8 将含有 RNA 沉淀的离心管静置干燥沉淀 5 min～10 min，用 20 μL DEPC 处理水将沉淀充分溶 解，在 -20℃ 条件下保存备用。 6 反转录 6.1 cDNA 的合成：将溶解的 RNA 按照反转录试剂盒说明书反转录合成 cDNA。 6.2 cDNA 的合成体系为 10 μL：5×PrimescriptTM Buffer 2.0 μL，PrimescriptTM RT Enzyme Mix Ⅰ0.5 μL，Random 6 mers 1.0 μL，RNA 2.0 μL，Rnase Free H2O 4.5 μL。混匀后放入 PCR 自动扩 增仪中进行反转录（RT）反应。 6.3 cDNA 的合成条件为：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 5 min。反转录后得到的 cDNA 置于 -20℃保 存。 7 PCR 扩增 7.1 PCR 反应体系：10×PCR Buffer 2.5μL、MgCl2（25 mM）2μL、dNTP (2.5 mM) 2μL、TaqDNA 聚合酶 (5 U/μL) 0.125μL、引物 P1 (10 μmol/L) 1μL、引物 P2 (10 μmol/L) 1μL、ddH2O 14.375 μL、模板 cDNA 2μL，总体系 25μL。 7.2 PCR 反应条件：94℃ 预变性 5 min，94℃ 30 s，51℃ 30 s， 72℃ 30 s 的循环，进行 35 个循 环，最后 72℃ 延伸 8 min，4℃ 保存。 8 PCR 产物的电泳检测 8.1 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶（见附录 A）。 8.2 取 5 μL PCR 产物与 1μL 6×上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在一加样孔中加入 DNA 分 子量标准（DL600），以 5 V/cm 恒压电泳，采用凝胶成像系统判定核酸片段大小。 9 结果判定 9.1 阳性对照出现一条 274 bp 大小的条带，且阴性对照样本不出现条带。 9.2 在满足 10.1 条件下，被检样品的 PCR 产物经电泳后出现一