ICS 65.020.30 B 41 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 1842—2014 山羊支原体山羊肺炎亚种 PCR 检测技术规范 2014 - 09 - 19 发布 四川省质量技术监督局 2014 - 10 - 01 实施 发 布 DB51/T 1842—2014 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 设备和试剂 ........................................................................ 1 5 DNA 提取........................................................................... 2 6 PCR 扩增........................................................................... 2 7 PCR 产物的电泳检测................................................................. 3 8 结果判定 .......................................................................... 3 9 废弃物无害化处理 .................................................................. 3 附录 A（规范性附录） 相关试剂的配制 .................................................. 4 I DB51/T 1842—2014 前 言 本标准附录A为规范性附录。 本标准由四川省农业厅提出。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：西南民族大学。 本标准主要起草人：杨发龙、张焕容、王远微、岳华、汤承、张斌、任玉鹏。 II DB51/T 1842—2014 山羊支原体山羊肺炎亚种 PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了山羊支原体山羊肺炎亚种的PCR检测方法。 本标准适用于山羊支原体山羊肺炎亚种的检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB T6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 《兽医实验室生物安全技术管理规范》（2003农业部公告第302号） 3 术语和定义 本标准采用下列术语和定义。 3.1 山羊支原体山羊肺炎亚种 Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae 属于柔膜体纲支原体目支原体科支原体属丝状支原体簇的成员，是引起山羊传染性胸膜肺炎 （contagious caprine pleuropneumonia, CCPP）的病原，其典型菌株为 F38。 3.2 聚合酶链式反应（PCR） Polymerase chain reaction 是一种分子生物学技术，用于体外大量扩增特定的 DNA 片段。 4 设备和试剂 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.1.7 4.1.8 主要仪器和设备 PCR 扩增仪 电泳仪、水平电泳槽 凝胶成像系统 冷冻高速离心机 微量高速离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作） 高压灭菌锅 恒温水浴锅 移液器（0.1 μL～10 μL、2 μL～20 μL、20 μL～200 μL、200 μL～1000 μL） 1 DB51/T 1842—2014 4.2 主要试剂 4.2.1 引物（10 μmol/L） P1：5- ATCATTTTTAATCCCTTCAAG -3 P2：5- TACTATGAGTAATTATAATATATGCAA -3 扩增片段大小为 316 bp。 4.2.2 DNA 提取试剂：蛋白酶 K、十二烷基硫酸钠（SDS）、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇。 4.2.3 PCR 反应试剂：Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（每种浓度为 2.5 mmol/L）、 10×PCR Buffer(无 Mg2+)。 4.2.4 STE 缓冲液（见附录 A） 4.2.5 TAE 电泳缓冲液（见附录 A） 4.2.6 6×上样缓冲液（6×Loading Buffer） 4.2.7 琼脂糖（电泳级） 4.2.8 核酸染料(Goldview) 4.2.9 DNA 分子量标准 4.2.10 水：所用水应符合 GB/T 6682 中三级水（三蒸水）规格。 4.2.11 阳性对照：标准参考菌株作为阳性对照。 4.2.12 阴性对照：用 GB/T 6682 中三级水代替 PCR 扩增模板作为阴性对照。 5 DNA 提取 5.1 样本处理 5.1.1 组织样本：肺等组织样本，按 1 g 加入 1 mL 的 STE 缓冲液，剪碎并研磨，3000 r/min 进行离 心 10 min，取上清液，12000 r/min 进行离心 20 min，弃上清，沉淀用于 DNA 提取。 5.1.2 鼻腔拭子样本：将鼻腔拭子浸入 1 mL 的 STE 缓冲液中 30 min， 充分涮洗，贴管壁挤干拭子， 12000 r/min 离心 20 min，弃去上清，收集沉淀用于 DNA 提取。 5.1.3 胸腔渗出液：取 500 μL 胸腔渗出液，加入 500 μL STE 缓冲液，混匀，12000 r/min 离心 20 min, 弃上清，收集沉淀用于 DNA 提取。 5.1.4 液体培养物：取 1mL 液体培养物,12000 r/min 离心 20 min, 弃上清，收集沉淀用于 DNA 提取。 5.1.5 对照样本：阴阳性对照样本处理与检测样本处理方法相同。 5.2 DNA 提取方法 5.2.1 向上述沉淀中加入 500 μL STE 缓冲液，振荡重悬。 5.2.2 加入 10% SDS 溶液 20 μL，20mg/mL 蛋白酶 K 10 μL，混匀，在 56℃水浴 60 min。 5.2.3 加入等体积 530 μL 的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混合液，混匀，12000 r/min 离心 5 min。 5.2.4 定量转移上清液到另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）混合液，颠倒混匀， 12000r/min 离心 5 min。 5.2.5 取上清，加入 2.5 倍体积的预冷无水乙醇，-20 ℃沉淀 30 min，12000 r/min 离心 5 min，弃 去上清液。 5.2.6 用 1 mL 70%乙醇漂洗，12000 r/min 离心 5 min，弃上清液。 5.2.7 室温干燥，DNA 沉淀用 25 μL 无菌三蒸水溶解作为模板，-20 ℃保存备用。 6 PCR 扩增 2 DB51/T 1842—2014 6.1 PCR 反应体系 总反应体系 25 μL，包括以下成份：10×PCR Buffer 2.5 μL、MgCl2（25 mM） 2 μL 、dNTP(2.5 mM) 2 μL、TaqDNA 聚合酶(5 U/μL) 0.15 μL、引物 P1（10 μmol/L）1 μL、引物 P2（10 μmol/L）1 μL、水 14.50 μL、模板 DNA 2 μL。PCR 扩增设置阳性。 6.2 PCR 反应条件 94 ℃ 预变性 3 min，然后进行 94 ℃ 30 s, 47 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s 的循环，进行 35 个循环，最后 72 ℃ 延伸 10 min，4℃保存。 7 PCR 产物的电泳检测 7.1 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2% 琼脂糖凝胶（见附录 1）。 7.2 取 5 μL PCR 产物与 1 μL 6×上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在另一加样孔中加入 DNA 分子量标准，以 5 V/cm 恒压电泳，采用凝胶成像系统判定核酸片段大小。 8 结果判定 8.1 阳性对照出现一条 316 bp 大小的条带，且阴性对照不出现条带。 8.2 在满足 8.1 的条件下，被检样品的 PCR 产物经电泳后出现一条 316 bp 的条带判定为阳性（+）， 即样本中含有山羊支原体山羊肺炎亚种 DNA；被检样品的 PCR 产物经电泳后不出现 316 bp 的条带判定 为阴性（-）。 9 废弃物无害化处理 按GB 16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程处理。废弃物实行无害化处理。 3 DB51/T 1842—2014 AA 附 录 A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 STE缓冲液 0.1 mol/L NaCl 10 mmol/L Tris.HCl(pH8.0) 1 mmol/L EDTA (pH8.0) A.2 TAE电泳缓冲液（pH8.0） 50×TAE 电泳缓冲液贮存液： Tris 碱 242 g EDTA 37.2 g 冰乙酸 57.1mL 加双蒸水至 1000 mL，应用前用双蒸水将 50×TAE 电泳缓冲液进行 50 倍稀释。 A.3 1%的琼脂糖电泳凝胶板制备 琼脂糖 1 g 1×TAE 电泳缓冲液 100 mL 将琼脂糖放入TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60 ℃左右时加入5 μL的核酸染料，混匀，均 匀倒板，厚度为3 mm～5 mm。 _________________________________ 4 DB51/T 1842—2014