ICS 65.020.30 B 41 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 1828—2014 牦牛源沙门氏菌 PCR 检测技术规范 2014 - 09 - 19 发布 四川省质量技术监督局 2014 - 10 - 01 实施 发 布 DB51/T 1828—2014 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 设备和试剂 ........................................................................ 1 5 DNA 提取........................................................................... 2 6 PCR 扩增........................................................................... 3 7 PCR 产物的电泳检测................................................................. 3 8 结果判定 .......................................................................... 3 9 废弃物处理 ........................................................................ 3 附录 A（规范性附录） 相关试剂配制 .................................................... 4 I DB51/T 1828—2014 前 言 本标准附录A为规范性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：西南民族大学。 本标准主要起草人：张焕容、汤承、岳华、杨发龙、王永、张斌、任玉鹏、王远微。 II DB51/T 1828—2014 牦牛源沙门氏菌 PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了牦牛源沙门氏菌的PCR检测方法。 本标准适用于牦牛源沙门氏菌的检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程。 《兽医实验室生物安全技术管理规范》（2003农业部公告第302号）。 3 术语和定义 本标准采用下列术语和定义。 3.1 沙门氏菌属 salmonella 是一群寄生于人和动物肠道内的革兰阴性杆菌，生化特性和抗原结构相似，兼性厌氧。绝大多数发 酵葡萄糖产酸产气，也偶尔有不产气的。在三糖铁琼脂上常产生 H2S。 3.2 牦牛源沙门氏菌 salmonella in Yak 是指从牦牛实质器官、粪便和肉品中分离鉴定的沙门氏菌，包括致病性和非致病性沙门氏菌。致病 性沙门氏菌常引起犊牦牛副伤寒，犊牦牛或青年牦牛急性胃肠炎和败血症及其他组织局部炎症。且为人 类食物中毒的主要病原之一。 4 设备和试剂 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 主要仪器和设备 PCR 扩增仪 电泳仪、水平电泳槽 凝胶成像系统 冷冻高速离心机 微量高速离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作） 高压灭菌锅 1 DB51/T 1828—2014 4.1.7 4.1.8 4.2 恒温水浴锅 移液器（0.1 μL~10 μL、2 μL~20 μL、20 μL~200 μL、200 μL~1000 μL） 主要试剂 4.2.1 引物（10 μmol/L） 上游引物：5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’； 下游引物：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’。 引物扩增片段大小为 284 bp。 4.2.2 DNA 提取试剂：蛋白酶 K、十二烷基硫酸钠（SDS）、Tris 饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇。 4.2.3 PCR 反应试剂：Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（每种浓度为 2.5 mmol/L）、 10×PCR Buffer(无 Mg2+)。 4.2.4 STE 缓冲液（见附录 A） 4.2.5 TAE 电泳缓冲液（见附录 A） 4.2.6 6×上样缓冲液（6×Loading Buffer） 4.2.7 琼脂糖（电泳级） 4.2.8 核酸染料(Goldview) 4.2.9 DNA 分子量标准 DL600 4.2.10 水：所用水应符合 GB/T 6682 中三级水（三蒸水）规格。 4.2.11 阳性对照：标准参考菌株作为阳性对照。 4.2.12 阴性对照：用 GB/T 6682 中三级水代替 PCR 扩增模板作为阴性对照。 5 DNA 提取 5.1 样本处理 5.1.1 粪便样本：无菌取约 1 g 粪便接种至 10 mL 缓冲蛋白胨水（BPW）增菌液，37℃培养 24 h。取 1mL BPW 增菌液分别接种于 10 mL 四硫磺酸钠亮绿（TTB）增菌液， 42℃培养 24 h。1 mL 增菌液 12000 r/min 离心 20 min, 弃上清，收集沉淀用于 DNA 提取。 5.1.2 组织样本：按 1g 加入 1mL 的 STE 缓冲液进行研磨，3000 r/min 进行离心 10 min，取上清液， 12000 r/min 进行离心 20 min，弃上清，沉淀用于 DNA 提取。 5.1.3 固体培养物：用接种环取固体培养基上的菌落用于 DNA 提取。 5.1.4 液体培养物：12000 r/min 离心 20 min, 弃上清，收集沉淀用于 DNA 提取。 5.1.5 对照样本 DNA 提取与检测样本处理方法相同。 5.2 DNA 提取方法 5.2.1 上述沉淀中加入 500 μL STE 缓冲液，使其重悬。 5.2.2 加入 10% SDS 溶液 20 μL，20 mg/mL 蛋白酶 K10 μL，混匀，在 56℃水浴 60 min。 5.2.3 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），混匀，12000 r/min 离心 5 min。 5.2.4 转移上清到另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000 r/min 离心 5 min。 5.2.5 取上清，加入 2.5 倍体积的预冷无水乙醇，-20℃沉淀 30 min，12000 r/min 离心 5 min，弃去 上清液。 5.2.6 用 1 mL 70%乙醇漂洗，12000 r/min 离心 5 min，重复 2-3 次。 2 DB51/T 1828—2014 5.2.7 6 室温干燥，DNA 沉淀用 25 μL 无菌三蒸水溶解作为模板，-20℃保存备用。 PCR 扩增 6.1 每次进行 PCR 扩增时，除检测样品外，均需设置阳性和阴性对照。 6.2 PCR 反应体系： 10 × PCR Buffer 2.0 μL，10 mmol/ L dNTPs 2.5 μL，Taq 酶 0.5 μL，模板 DNA（空白对照用水代替）1 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，水 17 μL，总体积 25 μL。 6.3 PCR 反应条件： 94℃预变性 5 min；94 ℃变性 45 s；60 ℃ 退火 45 s；72 ℃ 延伸 10 min，依 次进行 30 个循环。 7 PCR 产物的电泳检测 7.1 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶（见附录 A）。 7.2 取 5 μL PCR 产物与 1μL 6×上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在一加样孔中加入 DNA 分子 量标准（DL600），以 5 V/cm 恒压电泳，采用凝胶成像系统判定核酸片段大小。 8 结果判定 8.1 阳性对照出现一条 284bp 大小的条带，且阴性对照不出现条带。 8.2 在满足 8.1 的条件下，被检样品的 PCR 产物经电泳后出现一条 284bp 的条带判定为核酸阳性（+）； 被检样品的 PCR 产物经电泳后不出现 284bp 的条带判定为核酸阴性（-）。 9 废弃物处理 按GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程处理。废弃物实行无害化处理。 3 DB51/T 1828—2014 AA 附 录 A （规范性附录） 相关试剂配制 A.1 缓冲蛋白胨水（BPW） A.1.1 成分 蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钠（含12 个结晶水） 磷酸二氢钾 蒸馏水 pH 7.2±0.2 A.1.2 10.0 g 5.0 g 9.0 g 1.5 g 1 000 mL 制法 将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121 ℃15min。 A.2 STE缓冲液 0.1 mol/L NaCl 10 mmol/L Tris.HCl(pH8.0) 1 mmol/L EDTA (pH8.0) A.3 TAE电泳缓冲液（pH8.0） 50×TAE 电泳缓冲液贮存液： Tris 碱 242 g EDTA 37.2 g 冰乙酸 57.1 mL 加双蒸水至 1000 mL，应用前用双蒸水将 50×TAE 电泳缓冲液进行 50 倍稀释。 A.4 2%的琼脂糖电泳凝胶板制备 琼脂糖 2 g 1×TAE 电泳缓冲液 100 mL 将琼脂糖放入TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60℃左右时加入5 μL的核酸染料，混匀，均 匀倒板，厚度为3mm-5mm。 _____