ICS 65.020.30 B 41 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 1835—2014 基因 C 型鸭甲型肝炎诊断技术规范 2014 - 09 - 19 发布 四川省质量技术监督局 2014 - 10 - 01 实施 发 布 DB51/T 1835—2014 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 临床诊断 .......................................................................... 1 5 病毒分离 .......................................................................... 2 6 聚合酶链式反应 .................................................................... 2 7 诊断结果判断 ...................................................................... 4 8 废弃物无害化处理 .................................................................. 4 附录 A（规范性附录） 相关试剂配制 .................................................... 5 I DB51/T 1835—2014 前 言 本标准附录A为规范性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：西南民族大学。 本标准主要起草人：张焕容、岳华、汤承、杨发龙、张斌、任玉鹏、王远微。 II DB51/T 1835—2014 基因 C 型鸭甲型肝炎诊断技术规范 1 范围 本标准规定了基因C型鸭甲型病毒性肝炎的临床诊断、病毒分离和反转录聚合酶链式反应检测的技 术要求。 本标准适用于基因C型鸭甲型病毒性肝炎的诊断，反转录聚合酶链式反应适用于基因C型鸭甲肝病毒 的检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程。 《兽医实验室生物安全技术管理规范》（2003农业部公告第302号）。 3 术语和定义 本标准采用下列术语和定义。 3.1 基因C型鸭甲肝病毒 Genotype C Duck Hepatitis A Virus 鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis, DVH ）是由三种血清型的鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus, DHV）引起雏鸭的一种以肝脏病变为主的急性、高度致死性和接触性传染病。三种血清型 DHV 之间不 发生交叉反应，临床上最常见的为血清Ⅰ型 DHV，又称鸭甲型肝炎病毒( Duck hepatitis A virus, DHAV)， 简称鸭甲肝病毒，为小 RNA 病毒科成员。根据基因组成差异，DHAV 分为基因 A 型、B 型和 C 型 3 种基因型，分别对应传统血清Ⅰ型 DHAV，“台湾新型”和“韩国新型”DHAV。目前在我国大陆流行的主 要是基因 A 型和 C 型 DHAV。由基因 C 型 DHAV 引起的 DVH 称为基因 C 型鸭甲型病毒性肝炎。 3.2 聚合酶链式反应 PCR 即聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称 PCR，是一种分子生物学技术，用于体外大量 扩增特定的 DNA 片段。 4 4.1 临床诊断 临床症状 主要发生于 1~3 周龄以内的雏鸭，发病初期精神萎顿，废食，眼半闭呈昏睡状，以头触地，不久即 1 DB51/T 1835—2014 出现神经症状，运动失调，身体倒向一侧，两腿痉挛踢动，死前头向背部扭曲，呈角弓反张状，两腿伸 直向后张开。 4.2 剖检病变 肝脏肿大、质脆、色暗淡或发黄，表面有大小不等的出血斑点。 5 病毒分离 5.1 病料采集 无菌采集病鸭肝组织，冷藏尽快送检，如不能及时检测，应保存在-20℃。 5.2 病毒分离 5.2.1 病料处理 无菌采集病死鸭肝脏，按病料与灭菌生理盐水质量体积比1:3匀浆，将匀浆置于-40℃中反复冻融3 次，10000 r/min 离心15 min，上清液加入 2000 U/mL 双抗，37℃作用30 min后用细菌滤器进行过滤除 菌，作为接种材料。 5.2.2 病料接种 尿囊腔接种10日龄～12日龄鸭胚，每胚接种0.2 mL，每个样品各接种4枚，37℃孵育，每天观察3 次。 5.2.3 收毒 弃去24 h内死亡鸭胚，收集24 h～120 h内死亡鸭胚胚体并与尿囊液混合匀浆后，反复冻融3次，10000 r/min离心15 min，取上清液盲传3代，获得的病毒液-20℃保存，作为被检材料。 6 聚合酶链式反应 6.1 主要设备 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.1.5 6.1.6 6.1.7 6.1.8 6.2 PCR 扩增仪 电泳仪、水平电泳槽 凝胶成像系统 冷冻高速离心机 微量高速离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作） 高压蒸汽灭菌锅 恒温水浴锅 移液器（0.1 μL~10 μL、2 μL~20 μL、20 μL~200 μL、200 μL~1000 μL） 主要试剂 6.2.1 引物（10 μmol/L） 上游引物：5’- TCCAACAGGGTCAAAGC -3’； 下游引物：5’- AACTACTACAAGTCTGCCACG -3’。 引物扩增片段大小为 194 bp。 2 DB51/T 1835—2014 6.2.2 RNA 提取试剂：Trizol 试剂、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC 水、PrimescriptTM RT 试剂盒。 6.2.3 PCR 反应试剂：Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（每种浓度为 2.5 mmol/L）、 10×PCR Buffer(无 Mg2+)。 6.2.4 STE 缓冲液（组成及配制方法见附录 A） 6.2.5 TAE 电泳缓冲液（组成及配制方法见附录 A） 6.2.6 6×上样缓冲液（6×Loading Buffer） 6.2.7 琼脂糖（电泳级） 6.2.8 核酸染料(Goldview) 6.2.9 DNA 分子量标准： 根据目的片段大小，使用 600 bp DNA Marker。 6.2.10 水：所用水应符合 GB/T 6682 中三级水（三蒸水）规格。 6.2.11 阳性对照：标准参考毒株作为阳性对照。 6.2.12 阴性对照：用 GB/T 6682 中三级水代替 PCR 扩增模板作为阴性对照。 6.3 6.3.1 6.3.2 6.3.3 6.4 样本处理 组织样本：肝脏等组织样本，取 1 g 进行研磨，DEPC 水稀释至 200 μL，用于 RNA 提取。 培养病毒液：取 200 μL 分离培养的病毒液直接用于提取 RNA。 对照样本 RNA 提取与检测样本处理方法相同。 RNA 提取方法 6.4.1 取 200 μL 的被检材料于 DEPC 处理过的 1.5 mL EP 管中，加入 800 μL Trizol 试剂，反复吹打 混匀，室温静置 5 min，使细胞完全裂解。 6.4.2 加 300 μL 氯仿，剧烈振荡呈乳白色，充分混匀后，静置 5 min。 6.4.3 将 EP 管经 12000 r/min 4℃离心 15 min，管内溶液分为上层水相和下层无机相，RNA 即在上层 水相，小心吸取上层水相转移至另一个经 DEPC 处理过的 1.5 mL 的 EP 管中。 6.4.4 加等体积的异丙醇溶液沉淀 RNA，轻轻上下颠倒，室温静置 10 min，12000 r/min 4℃离心 10 min。 6.4.5 弃去上清液，加 1 mL75%的乙醇溶液轻轻洗涤沉淀，清除有机试剂，12000 r/min 4℃离心 5 min。 6.4.6 弃去上清液，室温干燥沉淀 5 min～10 min，RNA 沉淀用 25 μLDEPC 处理水充分溶解作为模板， -20℃条件下保存备用。 6.5 cDNA 的合成：将溶解的 RNA 按照反转录试剂盒说明书反转录合成 cDNA。 6.6 cDNA 的合成体系为 10 μL：5×PrimescriptTM Buffer 2.0 μL，PrimescriptTM RT Enzyme MixⅠ 0.5 μL，Random 6 mers 1.0 μL，RNA 2.0 μL，Rnase Free H2O 4.5 μL。混匀后放入 PCR 自动扩增仪 中进行反转录（RT）反应。 6.7 cDNA 的合成条件为：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 5 min。反转录后得到的 cDNA 置于 -20℃保 存。 6.8 PCR 扩增 6.8.1 每次进行 PCR 扩增时，除检测样品外，均需设置阳性和阴性对照。 6.8.2 PCR 反应总反应体系 25 μL，包括以下成份：10×PCR Buffer 2.5 μL、MgCl2（25 mM）2 μL、 dNTP（2.5 mM）2 μL、TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.125 μL、上游引物（10 μmol/L）1 μL、下游引物（10 μmol/L）1 μL、水 14.375 μL、cDNA 模板 2 μL。 6.8.3 反应程序为：95℃ 预变性 5 min；95℃ 变性 45 s，58℃退火 45