ICS 65.020.30 B 41 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 1836—2014 牦牛源沙门氏菌分离鉴定技术规范 2014 - 09 - 19 发布 四川省质量技术监督局 2014 - 10 - 01 实施 发 布 DB51/T 1836—2014 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 设备和试剂 ........................................................................ 2 5 分离培养 .......................................................................... 3 6 生化试验 .......................................................................... 4 7 PCR 鉴定........................................................................... 4 8 报告结果的表示 .................................................................... 5 9 废弃物无害化处理 .................................................................. 5 附录 A（规范性附录） 相关试剂配制 .................................................... 6 I DB51/T 1836—2014 前 言 本标准附录A为规范性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准发布。 本标准起草单位：西南民族大学。 本标准主要起草人：张焕容、汤承、岳华、杨发龙、王永、张斌、任玉鹏、王远微。 II DB51/T 1836—2014 牦牛源沙门氏菌分离鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了牦牛源沙门氏菌的分离鉴定方法。 本标准适用于牦牛源沙门氏菌的分离及鉴定和牦牛沙门氏菌病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程。 《兽医实验室生物安全技术管理规范》（2003农业部公告第302号）。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 沙门氏菌属 salmonella 是一群寄生于人和动物肠道内的革兰阴性杆菌，生化特性和抗原结构相似，兼性厌氧。绝大多数发 酵葡萄糖产酸产气，也偶尔有不产气的。在三糖铁琼脂上常产生 H2S。 3.2 牦牛源沙门氏菌 salmonella in Yak 是指从牦牛实质器官、粪便和肉品中分离鉴定的沙门氏菌，包括致病性和非致病性沙门氏菌。致病 性沙门氏菌常引起犊牦牛副伤寒，犊牦牛或青年牦牛急性胃肠炎和败血症及其他组织局部炎症。且为人 类食物中毒的主要病原之一。 4 设备和试剂 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 主要仪器设备 CO2 培养箱 移液器 (0.1μL ~ 10μL、2μL ~ 20μL、20μL ~ 200μL、200μL ~ 1000μL)。 离心机 无菌工作台 1 DB51/T 1836—2014 4.1.5 4.1.6 4.2 4 PCR 扩增仪 电泳仪、水平电泳槽 培养基和试剂 (见附录 A) 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 4.2.7 4.3 缓冲蛋白胨水 (BPW) 四硫磺酸钠煌绿 (TTB) 增菌液 木糖赖氨酸脱氧胆盐 (XLD)琼脂 SS 培养基 麦康凯培养基 (MaCC) 三糖铁 (TSI) 琼脂 赖氨酸脱羧酶试验培养基 PCR 鉴定相关试剂 4.3.1 引物 （10 μmol/L） 上游引物：5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’ 下游引物：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’。 4.3.2 扩增目的片段大小为 284 bp。 4.3.3 DNA 提取试剂：蛋白酶 K、十二烷基硫酸钠 （SDS）、Tris 饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙 醇。 4.3.4 PCR 反应试剂：Taq DNA 聚合酶 （5 U/μL）、MgCl2 （25 mmol/L）、dNTP （每种浓度为 2.5 mmol/L）、10×PCR Buffer (无 Mg2+)。 4.3.5 STE 缓冲液 (见附录 A) 4.3.6 TAE 电泳缓冲液 (见附录 A) 4.3.7 6×上样缓冲液 (6×Loading Buffer) 4.3.8 琼脂糖 (电泳级) 4.3.9 核酸染料 (Goldview) 4.3.10 DNA 分子量标准 DL600。 4.3.11 水：所用水应符合 GB/T 6682 中三级水（三蒸水）规格。 4.3.12 阳性对照：标准参考毒株作为阳性对照。 4.3.13 阴性对照：用 GB/T 6682 中三级水代替 PCR 扩增模板作为阴性对照。 5 分离培养 5.1 样品的采集 无菌采取牦牛粪便、肉品或实质器官棉拭子。 5.2 预增菌 把采集的棉拭子置于 10 mL BPW 增菌液于 36℃±1℃ 培养 8 h～18 h。 5.3 增菌 取 1 mL 预增菌液转种于 10 mL TTB 增菌液内，于 42℃±1℃ 培养 18 h～24 h。 2 DB51/T 1836—2014 5.4 分离培养 分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于 SS 琼脂平板和 XLD 平板于 36℃±1℃ 培养 18 h～24 h 观察各个平板上生长的菌落, 挑取 SS 平板上灰白色、半透明、圆珠状、边缘整齐、光滑湿润、中心 黑色，中等大小的菌落 3～5 个或透明，针尖大小的菌落，和 XLD 平板上呈粉红色，带或不带黑色中 心的菌落 3～5 个，经革兰氏染色镜检。然后将 SS 平板和 XLD 平板上 G- 的菌落分别划线接种于麦 康凯平板上，于 36℃±1℃ 培养 18 h～24 h， 观察麦康凯平板上生长的菌落，挑取 3～5 个细小无色 菌落，划线接种于 SS 琼脂平板，36℃±1℃ 培养 24 h 进一步纯化。 6 生化试验 自 SS 琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再 于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36℃±1℃ 培 养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反 应结果见表 1。 表1 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验培养基 初步判断 ＋（－） ＋ 可疑沙门氏菌属 ＋（－） ＋（－） － 可疑沙门氏菌属 A ＋（－） ＋（－） ＋ 可疑沙门氏菌属 A A ＋/－ ＋/－ － 非沙门氏菌 K K ＋/－ ＋/－ ＋/－ 非沙门氏菌 斜面 底层 产气 硫化氢 K A ＋（－） K A A 注：K：产碱，A：产酸；＋：阳性，－：阴性；＋（－）：多数阳性，少数阴性；＋/－：阳性 或阴性。 7 7.1 PCR 鉴定 DNA 提取 7.1.1 固体培养基上的菌落用接种环钩取后用于 DNA 提取，液体培养基中的培养物经 12000 r/min 离心 20 min, 弃上清，收集沉淀用于 DNA 提取。向沉淀中加入 500 μL STE 缓冲液，振荡重悬。 7.1.2 加入 10% SDS 溶液 20 μL，20 mg/mL 蛋白酶 K 10 μL，混匀，在 56℃ 水浴 60 min。 7.1.3 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），混匀，12000 r/min 离心 5 min。 7.1.4 转移上清到另一离心管中， 加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）， 颠倒混匀，12000 r/min 离 心 5 min。 3 DB51/T 1836—2014 7.1.5 取上清，加入 2.5 倍体积的预冷无水乙醇，-20℃ 沉淀 30 min，12000 r/min 离心 5 min， 弃去上清液。 7.1.6 用 1 mL 70% 乙醇漂洗， 12000 r/min 离心 5 min，重复 2 次~3 次。 7.1.7 室温干燥，DNA 沉淀用 25 μL 无菌三蒸水溶解作为模板，-20℃保存备用。 7.1.8 对照样本 DNA 提取与检测样本处理方法相同。 7.2 PCR 扩增 7.2.1 每次进行 PCR 扩增时，除检测样品外，均需设置阳性和阴性对照。 7.2.2 PCR 反应总反应体系 25 μL，包括以下成份： 10 × PCR Buffer 2.0 μL，10 mmol/ L dNTPs 2.5 μL，Taq 酶 0.5 μL，模板 DNA1 μL ，上引物 1 μL，下引物 1 μL，水 17 μL，总体积 25 μL。 7.2.3 PCR 反应条件为 94℃预变性 5 min；94℃变性 45 s，60℃ 退火 45s，72℃ 延伸 30 s，共 30 个循环；72℃ 延伸 10 min；反应完毕 4℃保存。 7.3 PCR 产物的电泳检测 7.3.1 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶（见附录 A）。 7.3.2 取 5 μL PCR 产物与 1