ICS 11.220 B 41 备案号： 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB 42/T 1110—2015 牛支原体药物敏感性体外检测操作规程 Technique guideline on drug sensitivity test of Mycoplasma bovis in vitro （报批稿） 2015 - 10 - 30 发布 湖北省质量技术监督局 2015 - 12 - 20 实施 发 布 DB42/T 1110—2015 目 次 前 言 .............................................................................. II 引 言 ............................................................................. III 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 缩略语 ............................................................................ 1 4 原理 .............................................................................. 1 5 操作步骤 .......................................................................... 2 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 仪器与耗材 .................................................................... 菌株 .......................................................................... 操作步骤 ...................................................................... 结果判断 ...................................................................... 实验废弃物的处理 .............................................................. 2 2 2 3 3 附录 A（规范性附录） 试剂配制 ........................................................ 4 附录 B（资料性附录） 牛支原体颜色变化单位测定方法 .................................... 6 附录 C（规范性附录） 药物敏感性判断标准 .............................................. 7 参考文献 ............................................................................. 9 I DB42/T 1110—2015 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由华中农业大学提出。 本标准由华中农业大学归口管理。 本标准起草单位：华中农业大学。 本标准协作起草单位：随州市弘大畜牧有限责任公司、湖北省松滋市春珍肉牛养殖场。 本标准起草人：郭爱珍、贺晨飞、晁金、陈颖钰、胡长敏、曹永强、周春、陈焕春。 II DB42/T 1110—2015 引 言 牛支原体(Mycoplasma bovis, M. bovis) 是牛的一种重要病原体，主要导致牛肺炎，也可致乳腺炎、 关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种病症。该病在世界范围内流行。我省于2008 年在全国首次报道肉牛的牛支原体肺炎，发病率为50%～100%，病死率高达10%～50%，给养牛业造成 了巨大的经济损失。 目前牛支原体病的主要控制措施是抗生素治疗。但由于牛支原体无细胞壁，对常用内酰胺酶类抗菌 药不敏感，对其它抗菌药如喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖苷类等虽具有一定的敏感性，但治疗周期长， 效疗差，耐药性产生快。因此，体外药物敏感性检测能为临床治疗筛选敏感药物，提高临床治疗效果， 同时可用于监测牛支原体耐药性产生的趋势。 然而，目前国内外尚无牛支原体体外药物敏感性检测的技术标准，一定程度上阻碍了该病的有效防 治。为此，特制定本标准，旨在为我省牛支原体的有效防控提供技术支持，以推动我省养牛业的健康发 展。 III DB42/T 1110—2015 牛支原体体外药物敏感性检测操作规程 1 范围 本标准规定了牛支原体体外药物敏感性检测技术的缩略语、原理和操作步骤规程。 本标准适用于湖北地区牛支原体临床分离株的药物敏感性分析、耐药性流行病学调查和牛支原体病 的临床治疗。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 18597 危险废物贮存污染控制标准 DB42/T 1024 牛支原体肺炎检测技术 CLSI M100-S22 抗 生 素 敏 感 性 检 测 操 作 标 准 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 中华人民共和国国务院令（2003）第380号 医疗废物管理条例 3 缩略语 以下缩略语适用于本标准。 3.1 M.bovis 牛支原体 Mycoplasma bovis 3.2 PPLO 胸膜肺炎样微生物 Pleuropnenmonia-like Organism 3.3 MIC 最低抑菌浓度 Minimum inhibitory concentration 3.4 CCU 颜色变化单位 Color changing unit 3.5 ATCC 美国菌种保藏中心 American Type Culture Collection 3.6 CLSI 临床和实验室标准协会 Clinical And Laboratory Standards Institute 4 原理 在液体培养基中，牛支原体生长产酸，将导致培养基颜色改变，由红色变为黄色。当抗生素发生抑 菌或杀菌作用时，因无牛支原体生长，培养基将维持红色。 抗生素抑制牛支原体生长的强弱以最低抑菌浓度(MIC)表示，用微量肉汤稀释法测定，具体方法如 下：在96孔板内依次加入倍比稀释的抗菌药，再加入等体积适当稀释的牛支原体液体培养物，置于37℃， 1 DB42/T 1110—2015 5% CO2培养箱中培养48h，观察每个孔内颜色的变化，颜色由红色变为黄色表示有牛支原体生长。以不 改变检测管颜色的药物最高稀释倍数所对应的药物浓度(g/mL)为MIC。 5 操作步骤 5.1 仪器与耗材 Ⅱ级生物安全柜，二氧化碳培养箱，96孔细胞培养板，微量可调移液器及枪头，2 mL一次性无菌 离心管，混匀器，冰箱，天平，高压消毒锅，0.22 µm微孔滤膜。 5.2 菌株 标准菌株：美国微生物菌种保藏中心牛支原体参考株M. bovis PG45（ATCC 25523）； 临床分离菌株：临床病料分离纯化的菌株，菌株鉴定按照DB42/T 1024中的要求进行。 5.3 操作步骤 5.3.1 抗菌药溶液配制 根据抗菌药特性，用相应溶剂（如1 M 氢氧化钠、乙醇或去离子水）将抗菌药溶解，然后用去离 子水将抗菌药稀释成1 mg/mL的储存液，-80℃保存。 使用前将储存液用去离子水稀释至所需工作液浓 度，4℃保存备用，各药物贮存液配制方法参照CLSI M100-S22，见附录A.1。 去离子水的制备按照GB/T 6682的要求进行。 5.3.2 菌株复苏鉴定 将保存于-20℃含20%甘油的菌液取出，吸取100 μL菌液接种于900 μL PPLO液体培养基内，置于普 通培养箱中37℃培养48 h～72 h。取20 μL复苏菌液转接于60 mm PPLO琼脂平板上，PPLO液体和固体培 养基配制见附录A.2，置于37℃，5% CO2培养箱中培养48 h～72 h，在显微镜下标记出形态典型的支原 体单菌落，在超净台内将标记的单菌落挑出，再次接于PPLO液体培养基内培养，取培养物进行16S rRNA 通用PCR和uvrC特异性PCR检测，方法见DB42/T 1024标准的要求。 5.3.3 牛支原体颜色变化单位测定 将牛支原体用PPLO液体培养基作10倍递增稀释，置于普通培养箱中37℃二氧化碳培养箱中培养48 h～72 h，观察培养液的颜色变化，以出现颜色变化的最后1管所对应的牛支原体稀释倍数作为颜色变化 单位，表示为CCU /mL，具体操作见附录B.1。 5.3.4 最低抑菌浓度测定 采用微量肉汤稀释法测定牛支原体最低抑菌浓度。在96孔板内，第1～9列每孔加入100 CCU PPLO 液体培养基pH值7.6，第1列加入工作浓度的抗菌药，混匀后从各孔中取100 μL至第2列各孔，依次倍比 稀释至第9列，第9列弃去100 μL，使每孔体积相同。第10列各孔加入100 L PPLO培养基作为牛支原体 生长阳性对照；第11列各孔加入200 L pH值 6.8 PPLO培养基呈黄色作为对照；12列各孔加入200 μL培 养基作为无菌阴性对照呈红色。 将复苏和鉴定正确的牛支原体液体培养物按1:10接种至PPLO液体培养基中，置于37℃，5% CO2培 养箱中培养24 h，菌量约为108～109 CCU/mL后，将菌液稀释至104倍，备用。第1～9列各孔加入100 μL 预先稀释好的菌液；第10列加入100 L菌液；第11列和第12列不加菌液。每株菌做3个重复。将培养板 用封口膜密封，置于37℃，普通培养箱中培养48h，在不同时间观察每个孔内颜色的变化并记录，并与 2 DB42/T 1