ICS 07.080 B41 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1327—2013 番鸭呼肠孤病毒 RT-PCR 检测方法 2013 - 02 - 20 发布 福建省质量技术监督局 2013 - 05 - 20 实施 发 布 DB35/T 1327—2013 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 方法原理 .......................................................................... 1 4 实验室准备 ........................................................................ 1 5 实验室条件 ........................................................................ 2 6 操作程序 .......................................................................... 2 7 分析判定 .......................................................................... 2 8 样品无害化处理 .................................................................... 3 附录 A（规范性附录） 试剂的配制 ...................................................... 4 附录 B（资料性附录） 番鸭呼肠孤病毒 S1 基因序列 ....................................... 6 参考文献 ............................................................................. 7 I DB35/T 1327—2013 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由福建省农业厅提出并归口。 本标准由福建省农业科学院畜牧兽医研究所负责起草。 本标准主要起草人：林锋强，陈少莺，胡奇林，陈仕龙，王劭，程晓霞，朱小丽，李兆龙，黄冬菊， 陈建翊。 II DB35/T 1327—2013 番鸭呼肠孤病毒 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了应用 RT-PCR 方法检测番鸭呼肠孤病毒的材料准备、操作方法、结果判定及样品无害 化处理。 本标准适用于番鸭呼肠孤病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法原理 将番鸭呼肠孤病毒RNA基因逆转录为互补DNA，以此为模板，利用番鸭呼肠孤病毒（muscovy duck reovirus，MDRV）S1基因序列（见附录B）设计的一对引物,进行PCR特异性扩增，扩增与预期大小300bp 相符的片段，对病毒核酸进行定性。 4 实验室准备 4.1 微量移液器 4.2 高速冷冻离心机 4.3 聚合酶链式反应仪 4.4 电泳仪 4.5 凝胶成像系统 4.6 PBS(0.01mol/L pH7.2) 配制方法按附录 A 中 A.2 进行。 4.7 TRIzol 试剂 4.8 三氯甲烷（分析纯） 4.9 异丙醇（分析纯） 4.10 无水乙醇（分析纯） 4.11 50×TAE 缓冲液 配制方法按附录 A 中 A.3 进行。 1 DB35/T 1327—2013 4.12 电泳级琼脂糖 配制方法按附录 A 中 A.4 进行。 4.13 AMV 反转录酶 4.14 RNA 酶抑制剂 4.15 Taq DNA 聚合酶 4.16 SYBR 荧光染料 配制方法按附录 A 中 A.5 进行。 4.17 上样缓冲液 配制方法按附录 A 中 A.6 进行。 4.18 灭菌双蒸馏水 配制方法按附录 A 中 A.7 进行。 4.19 MgCl2 溶液 4.20 5×反转录反应缓冲液 配制方法按附录 A 中 A.8 进行。 4.21 Random 9mers 配制方法按附录 A 中 A.9 进行。 4.22 2.5mmoL dNTPs 配制方法按附录 A 中 A.10 进行。 4.23 10×PCR Buffer 配制方法按附录 A 中 A.11 进行。 4.24 引物 配制方法按附录 A 中 A.12 进行。 4.25 DNA 分子量标准(DL2000) 4.26 MDRV 细胞毒 配制方法按附录 A 中 A.13 进行。 注：建议使用经验证有效的商品化核酸提取、反转录、聚合酶链式反应试剂盒，配合本标准开展 RT-PCR 检测。 5 实验室条件 RT-PCR 实验室应划分出 RNA 提取区、基因扩增区、电泳区。 6 操作程序 6.1 样品的采集和处理 无菌采集病鸭或病鹅的样品（肝、脾、血液、分泌物或排泄物等），加无菌 PBS（0.01mol/L 制成 10％悬液，冻融 3 次，3000 g 离心 20min，取上清液，待提取 RNA。1) 1) 检测后的样品应进行高压消毒无害化处理。 2 pH7.2） DB35/T 1327—2013 6.2 实验对照 设立阳性对照、阴性对照。 6.3 RNA 的提取 每个样品取250μL上清液加入750μLTRIzol试剂，反复摇匀；室温（15℃～30℃）放置5min；加入 150μL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3 min；2℃～8℃10000 g离心15 min，RNA主要在上层水相中；把 水相转移到新管中，加入600μL异丙醇沉淀RNA，室温放置10 min；2℃～8℃10000 g离心10 min，移去 上清；加入1mL无水乙醇洗涤RNA沉淀，2℃～8℃不超过7500 g离心5 min，弃上清；沉淀室温放置，风 干5min～10 min。加入30μL灭菌双蒸馏水溶解，-20℃保存，备用。 6.4 反转录操作 在PCR管中依次加入：MgCl2溶液(25mmol/L) 2μL；5×反转录反应缓冲液2μL；dNTPs(2.5mmol/L) 1μL； Random 9mers(50pmol/μL) 0.5μL；RNA酶抑制剂(40U/μL) 0.25μL；AMV反转录酶(40U/μL) 0.5μL；样 品RNA 1μL；灭菌双蒸水调至总体积10μL。加样完毕后，12000 g离心15s，放置于PCR仪内，按下面程 序进行反转录：30℃ 10min，42℃ 30min，99℃ 5min，4℃结束反应。 6.5 PCR 检测操作 在PCR管中依次加入：RNA反转录产物10μL；MgCl2溶液(25mmol/L) 2μL；10×PCR Buffer 5μL；上游 引物(50pmol/μL) 1μL；下游引物(50pmol/μL) 1μL；Taq酶（5U/μL）0.25μL；灭菌双蒸水补足至总体 积为50μL。加完试剂后离心混合，将PCR管置于PCR仪内，按下面程序进行PCR反应：94℃预变性5min； 然后进入94℃1min，55℃ 1min，72℃1min的循环，共循环35次；72℃延伸10min；4℃结束扩增。PCR 产物电泳或保存在4℃冰箱。 6.6 电泳 6.6.1 制备 1%琼脂糖凝胶，配制见附录 A.3。 6.6.2 6.6.3 分别取 10μL PCR 产物和分子量标准与 1μL 上样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板加样孔。 5V/cm 电压电泳，30min。 7 结果判定 7.1 电泳后的凝胶用紫外凝胶成像仪扫描图片。 7.2 用 DNA 分子量标准比较判断 PCR 产物片断大小。 7.3 在阳性对照孔出现 300bp 扩增带，阴性对照无此扩增带时判定结果。 7.4 待检样品扩增产物出现 300bp 扩增带时，判定为番鸭呼肠孤病毒核酸阳性，否则判定为阴性 （图 1）。 3 DB35/T 1327—2013 图 1：RT-PCR 方法检测 MDRV 样品结果 1-2 阴性对照；3-4 阳性对照；M 分子量标准 4 DB35/T 1327—2013 A 附 录 A （规范性附录） 试 剂 的 配 制 A.1 实验室用水均采用GB/T 经验证有效的商品化试剂。 A.2 6682-2008 标准（三级水级别），所有试剂均为分析纯（AR）。推荐使用 PBS溶液(0.01mol/L pH7.2） 称取下列试剂，置于 1 L 烧杯中。 NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 .12H2O 3.58g KH2PO4 0.27g 向烧杯中加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；滴加浓盐酸调节pH值至7.2，然后加入去离子水 定容至l L；高温高压灭菌后，室温保存。 A.3 50×TAE电泳缓冲液配制 A2.1 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0) 乙二铵四乙酸二钠 18.61 g 去离子水 80mL 氢氧化钠 调 pH 至 8.0 去离子水 加至 100mL A2.2 TAE 电泳缓冲液(50×)配制 羟基甲基氨基甲烷(Tris) 242g 冰乙酸 57.1mL 0.5mol/LEDTA 溶液(pH8.0) 100mL 去离子水 加至 1000mL 用时用灭菌双蒸水稀释使用。 A.4 1%琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖 1.0g 1×TAE 电泳缓冲液 加至 100mL 微波炉中完全融化，摇匀，倒入电泳板中，凝固后取下梳子，备用。 A.5 SYBR Green I荧光染料溶液 用 1×TAE 电泳缓冲液将 SYBR