ICS 11.220 B 41 备案号：31304-2011 北 京 DB11 市 地 方 标 准 DB11/T 819—2011 锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范 Technical protocol for diagnosis of Koi Herpesvirus Disease 2011 - 08 - 09 发布 北京市质量技术监督局 2011 - 12 - 01 实施 发 布 DB11/T 819—2011 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准由北京市农业局提出。 本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。 本标准由北京市农业局组织实施。 本标准起草单位：北京市水产技术推广站。 本标准主要起草人：王姝、徐立蒲、张振国、王静波、曹欢、贾丽、殷守仁。 I DB11/T 819—2011 锦鲤疱疹病毒病诊断技术规范 1 范围 本标准规定了锦鲤疱疹病毒病（KHVD）的样品要求、临床症状及流行病学特征、PCR 检测、结果判 定。 本标准适用于锦鲤疱疹病毒病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 KHV：锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus） KHVD：锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease） PCR: 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） Taq酶：Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside triphosphate） 4 样品要求 4.1 水温 采集样品时的水温应在16℃～32℃。 4.2 品种 采样品种为锦鲤或鲤。 4.3 数量 按照SC/T 7103执行。 4.4 状态 1 DB11/T 819—2011 采集的样品不得腐败。 4.5 信息采集 需采集鲤或锦鲤发病情况、混养其它鱼类发病情况、采样水温等信息。 5 锦鲤疱疹病毒病临床症状及流行病学特征 5.1 患 KHVD 的锦鲤和鲤，具有下列临床症状： ——最显著的特征为烂鳃, 鳃出血并产生大量黏液,鳃丝溃烂； ——体表出现苍白的块斑和水泡；鳍条和尾鳍充血；鳞片上出现血丝； ——眼球凹陷； ——口腔和腹部充血和出血。 5.2 患 KHVD 的锦鲤和鲤，具有下列流行病学特征： ——混养池塘中,只有鲤或锦鲤（且不论大小）生病和死亡,而其它种类，如金鱼、草鱼等无此现象； ——水温在18℃～30℃时,特别是在25℃～28℃时, 鲤或锦鲤大量死亡,当水温升高或降低时,死亡 现象下降或停止； ——死亡极快，一条健康鱼从出现临床症状到死只有24h～48h；死亡率极高，疾病发生后在10天内, 死亡率可达80%～100%。 6 PCR 检测方法 6.1 试剂和材料 6.1.1 水：符合 GB/T 6682—2008 中一级水的规格。 6.1.2 KHV 阳性核酸片断：由农业部指定机构提供。 6.1.3 Taq 酶：－20℃保存，不能反复冻融或温度剧烈变化。 6.1.4 dNTP：10 mmoL/L。 6.1.5 氯化镁溶液浓度：25mmoL/L。 6.1.6 扩增 KHV 的 TK 基因中的 409bp 片断的引物：浓度为 100pmoL/μL。其序列如下： KHV-TK-F: 5’-GGG-TTA-CCT-GTA-CGA-G-3’； KHV-TK-R: 5’-CAC-CCA-GTA-GAT-TAT-GC-3’。 6.1.7 扩增 KHV 的 Sph 基因中 292bp 片断的引物：浓度为 100pmoL/μL。其序列如下： KHV-Sph-F：5’-GAC-ACC-ACA-TCT-GCA-AGG-AG-3’； KHV-Sph-R：5’-GAC-ACA-TGT-TAC-AAT-GCT-CGC-3’。 6.1.8 DEPC 水：用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水。 6.2 器材和设备 6.2.1 普通冰箱和超低温冰箱。 6.2.2 组织研磨器。 2 DB11/T 819—2011 6.2.3 离心机和离心管。 6.2.4 PCR 扩增仪。 6.2.5 水平电泳仪。 6.2.6 微量移液器及吸头。 6.2.7 紫外观察灯或凝胶成像仪。 6.3 样品处理 6.3.1 体长小于 4cm 的鱼苗取整条鱼，体长 4cm～6cm 的鱼苗取内脏（包括肾） ，体长大于 6cm 的鱼则 取肾、脾、鳃；无临床症状的鱼，另外需加取肠和脑组织。 6.3.2 将所取样品匀浆成糊状，按 1：10 的最终稀释度悬于磷酸盐缓冲液（参见附录 A.1） 。 6.3.3 将 450μL 悬液放入 1.5mL 的离心管，再加入 450μLCTAB 溶液（参见附录 A.2）并混匀，25℃ 作用 2 小时。 6.4 DNA 抽提 在含有样品的离心管中加入600μL抽提液Ⅰ（参见附录A.3），用力混合。12000r/min离心5min， 取上层水相（约800μL）。再加入700μL抽提液Ⅱ（参见附录A.4），用力混合。12000r/min离心5min， 取上层水相（约600μL）。再加入预冷的1.5倍体积的无水乙醇（约900μL），倒置数次混匀后，放置 离心管于－20℃下，至少8h后取出。12000r/min离心30min，倒去上清液。将离心管倒置于吸水纸上， 吸干液体。加11μL DEPC水溶解后，作为PCR模板。 6.5 DNA 扩增 6.5.1 使用 KHV-TK 引物的反应体系为 100μL：在 0.2mL 反应管中加入 10μL 模板、 2.5μL dNTP、 10μL 氯化镁溶液、10μL 10 倍 Taq 酶缓冲液（参见附录 A.5） 、KHV-TK-R 和 KHV-TK-F 各 1μL、2.5U Taq 酶、加 DEPC 水至 100μL。将反应管置于 PCR 扩增仪。反应程序：94℃变性 5min；95℃变性 1min、 50℃退火 1min、72℃延伸 1min，40 次循环；72℃延伸 10min；4℃保温。 6.5.2 使用 KHV-Sph 引物的反应体系为 100μL：在 0.2mL 反应管中加入 10μL 模板、2μL dNTP、8μ L 氯化镁溶液、10μL 10 倍 Taq 酶缓冲液、KHV-Sph-R 和 KHV-Sph-F 各 0.5μL、2.5U Taq 酶、加 DEPC 水至 100μL。将反应管置于 PCR 扩增仪。反应程序：94℃变性 30s；94℃变性 30s、63℃退火 30s、72℃ 延伸 30s，40 次循环；72℃延伸 7min；4℃保温。 6.6 设立对照 6.6.1 在 6.3 样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。 6.6.2 取 KHV 阳性核酸片断作为阳性对照。 6.6.3 取正常的鱼组织抽提核酸作为阴性对照。 6.6.4 取等体积的水代替模板作为空白对照。 6.7 琼脂糖电泳 用TBE电泳缓冲液（参见附录A.6），配制1.5%的琼脂糖平板（含1μL/mL EB，参见附录A.7）。将 平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6μL样品和2μL上样缓冲液（参见附录A.8）， 按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子量标准参考物作对照。5V/cm电泳约0.5h,当溴酚蓝到 达底部时停止。 3 DB11/T 819—2011 7 结果判定 7.1 PCR 检测结果的判读即在紫外光下观察扩增带。用 KHV-TK 基因引物，PCR 后阳性对照会出现一条 409bp 的 DNA 片段；用 KHV-Sph 基因引物，PCR 后阳性对照会出现一条 292bp 的 DNA 片段。阴性和空白 对照无上述核酸带。 7.2 如果被检测样品有临床症状，PCR 后能够得到 409bp 和/或 292bpDNA 片段者，则可确诊为 KHVD。 7.3 无临床症状样品，PCR 后能够得到 409bp 和/或 292bpDNA 片段者，则判定样品为 KHV 可疑。可疑 的样品可经基因测序确定是 KHV 后，判定为 KHV 阳性。 7.4 PCR 后没有得到 409bp 和 292bpDNA 片段者，判定为 KHV 阴性。 4 DB11/T 819—2011 附 录 A （资料性附录） 试剂配制 A.1 磷酸盐缓冲液 称取氯化钠（NaCl）7.9g，氯化钾（KCl）0.2g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.24g，磷酸氢二钠（Na2HPO4） 1.8g，溶于800mL蒸馏水中，调节溶液酸碱度至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。 A.2 CTAB溶液 按CTAB（hexadecyl trimethy ammonium bromide）2%，氯化钠（NaCl）1.4moL/L，乙二胺四乙酸 （EDTA）20mmoL/L，三羟基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）20mmoL/L配制，调节溶液酸碱度至7.5，用前加 巯基乙醇至终浓度为0.25%。 A.3 抽提液Ⅰ 1 mmoL/L 三羟基氨基甲烷饱和酚（Tris-饱和酚）、三氯甲烷（CHCl3）、异戊醇（C5H12O）按25： 24：1的比例混合，密闭避光保存。 A.4 抽提液Ⅱ 三氯甲烷（CHCl3）、异戊醇（C5H12O）按24：1的比例混合，密闭避光保存。 A.5 10 倍Taq酶缓冲液 按三羟基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl，酸碱度8.8）500mmoL/L，氯化钾（KCl）500mmoL/L，聚乙二醇 辛基苯基醚（Triton X-100）1%配制。 A.6 TBE电泳缓冲液（5 倍浓缩） 称取三羟基氨基甲烷（Tris）54g，硼酸（HBO3）27.5g，乙二胺四乙酸（EDTA）2.9g，加水至1000mL， 用稀盐酸（HCl）调节酸碱度到8.0。 A.7 EB （Ethidium Bromide，核酸染色剂） 用水配制成 10mg/L的浓缩液。用时每 10mL电泳液或琼脂中加 1μL。 A.8 6×上样缓冲液 溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚 蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加入氢氧化钠1滴，调至蓝色。 __________________________ 5