ICS 11.220 B 41 备案号：30905-2011 四 川 DB51 省 地 方 标 准 DB51/T 1302—2011 绵羊肺炎支原体 PCR 检测技术规范 Technical Specification for PCR Detection Method of Mycoplasma ovipneumoniae 2011 - 06 - 27 发布 四川省质量技术监督局 2011 - 07 - 01 实施 发 布 DB51/T 1302—2011 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语与定义 ........................................................................ 1 4 设备和试剂 ........................................................................ 1 5 DNA提取 ........................................................................... 2 6 PCR扩增 ........................................................................... 3 7 PCR产物的电泳检测 ................................................................. 3 8 结果判定 .......................................................................... 3 附录A（资料性附录） 试剂配制 ........................................................ 5 I DB51/T 1302—2011 前 言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准发布。 本标准起草单位：西南民族大学 四川省畜禽繁殖改良总站。 本标准主要起草人：杨发龙 岳华 王永 汤承 傅昌秀。 II DB51/T 1302—2011 绵羊肺炎支原体 PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了绵羊肺炎支原体的PCR（聚合酶链式反应）检测方法。 本标准适用于绵羊肺炎支原体的检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction （PCR） 是一种分子生物学技术，用于体外大量扩增特定的DNA片段。 3.2 引物 primer 是人工合成的两段寡核苷酸序列，用于聚合酶链式反应，其中一条引物与目标片段一端的一条DNA 模板链互补，另一条引物与目标片段另一端的另一条DNA模板链互补。 4 设备和试剂 4.1 主要仪器和设备 4.1.1 PCR 扩增仪 4.1.2 电泳仪、水平电泳槽 4.1.3 凝胶成像系统 4.1.4 冷冻高速离心机 4.1.5 微量高速离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作） 4.1.6 高压灭菌锅 1 DB51/T 1302—2011 4.1.7 恒温水浴锅 4.1.8 移液器（0.1μL-10μL、2μL-20μL、20μL-200μL、200μL-1000μL） 4.2 主要试剂 4.2.1 引物（10μmol/L） P1：5’-TGAACGGAATATGTTAGCTT-3’ P2：5’-GACTTCATCCTGCACTCTGT-3’ 4.2.2 DNA 提取试剂 蛋白酶K、十二烷基硫酸钠（SDS）、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇。 4.2.3 PCR 反应试剂 Taq DNA聚合酶（5U/μL） 、MgCl2（25mmol/L）、dNTP（每种浓度为 2.5mmol/L）、10×PCR Buffer(无 Mg )。 2+ 4.2.4 STE 缓冲液（见附录 A） 4.2.5 TAE 电泳缓冲液（见附录 A） 4.2.6 6×上样缓冲液（6×Loading Buffer） 4.2.7 琼脂糖（电泳级） 4.2.8 溴化乙锭溶液（1mg/mL） 4.2.9 DNA 分子量标准（100bp，200bp,300bp,400bp,500bp,600bp） 4.2.10 水 所用水应符合GB/T 6682中三级水（三蒸水）规格。 5 5.1 DNA 提取 样本处理 5.1.1 组织样本 肺等组织样本，按1g加入1mL的STE，进行研磨，3000r/min进行离心10min，取上清液，12000r/min 进行离心20min，弃上清，沉淀用于DNA提取。 5.1.2 棉拭子 将鼻腔拭子等棉拭子浸入1mL的STE缓冲液中30min，反复挤压，然后以12000r/min离心20min，弃去 上清，收集沉淀用于DNA提取。 5.1.3 胸腔渗出液 取500μL胸腔渗出液，加入500μL STE缓冲液，混匀，12000r/min离心20min, 弃上清，收集沉淀用 于DNA提取。 2 DB51/T 1302—2011 5.1.4 液体培养物 12000r/min离心20min, 弃上清，收集沉淀用于DNA提取。 5.2 DNA 提取方法 向上述沉淀中加入500 μL STE缓冲液，使其重悬。加入10%SDS溶液20μL，20mg/mL 蛋白酶K10μL， 混匀，在56℃水浴60min。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），混匀，12000r/min离心5min。转 移上清到另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000r/min离心5min。取上 清，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min离心5min，弃去上清液。用1mL 70% 乙醇漂洗，重复2次-3次，12000r/min离心5min。室温干燥，DNA沉淀用25μL无菌三蒸水溶解作为模板， -20℃保存备用。 6 PCR 扩增 每次对检测样品进行 PCR 扩增时，均需要设置阳性和空白对照。 PCR反应总反应体系 25μL，包括以下成份：10×PCR Buffer 2.5μL、MgCl（25mM） 2μL 、dNTP(2.5mM) 2 2μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.125μL、引物P1（10μmol/L）1μL、引物P2（10μmol/L）1μL、水 14.375μL、模板DNA（空白对照用水代替）2μL。 PCR 反应条件为 95℃ 预变性 5min，然后进行 95℃ 1min, 50℃ 1min, 72℃ 30s 的循环，进行 35 个循环，最后 72℃ 延伸 10min，4℃保存。 7 PCR 产物的电泳检测 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶（见附录 A）。取 5μL PCR 产物与 1μL 6×上样缓冲液混 合，分别加入样品孔，同时在另一加样孔中加入 DNA 分子量标准，以 5V/cm 恒压电泳，采用凝胶成像系 统进行拍照。 8 结果判定 阳性对照出现一条 360bp 左右大小的条带，且无模板空白对照不出现条带（见图 1） 。 在满足上述条件的情况下，被检样品的 PCR 产物经电泳后出现一条 360bp 左右的条带判定为阳性 （+）；被检样品的 PCR 产物经电泳后不出现 360bp 左右的条带判定为阴性（—）。 3 DB51/T 1302—2011 说明： M ── DNA 分子量标准； P ── 阳性对照； N ── 阴性对照。 图 1 阴、阳性对照 PCR 电泳图 4 DB51/T 1302—2011 AA 附 录 A （资料性附录） 试剂配制 试剂名称 1．STE 缓冲液 0.1 mol/L NaCl 10 mmol/L Tris.HCl(pH8.0) 1 mmol/L 2．TAE 电泳缓冲液（pH8.0） EDTA (pH8.0) 50×TAE 电泳缓冲液贮存液： Tris 碱 EDTA 242g 冰乙酸 37.2g 57.1mL 加双蒸水至 1000mL，应用前用双蒸水将 50×TAE 电泳缓冲液进行 50 倍稀释。 3．2%的琼脂糖电泳凝胶板制备 琼脂糖 2g 1×TAE 电泳缓冲液 100mL 将琼脂糖放入 TAE 电泳缓冲液中，加热融化，温度降至 60℃左右时加入溴化乙 锭（终浓度 0.5μg/mL），混匀，均匀倒板，厚度为 3mm-5mm。 _________________________________ 5